4 Получение ПЦР-фрагмента, несущего родоили видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для дифференциальной диагностики в пределах рода или таксона более высокого порядка; 5 Получение смеси специфических ПЦР-фрагментов в ходе проведения мультиплексной ПЦР для одновременной диагностики одного или нескольких заболеваний (инфекционных и/или генетических) [188]. Подбор эффективных праймеров – процесс эмпирический, соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения хороших праймеров: нужно выбирать праймеры с содержанием GC пар =50% и случайным распределением оснований. Следует избегать использования праймеров с протяженными полипуриновыми, полипиримидиновыми и другими неординарными последовательностями, а также последовательностей с устойчивыми вторичными структурами.
Необходимо поверять затравки на комплементарность друг другу, очевидно, что праймеры отжигающиеся с друг другом не смогут участвовать в амплификации интересующей нас последовательности.
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие – ложноотрицательный результат. Иными словами, если предполагается разработать видоспецифический праймер на какой либо микроорганизм, выбирается именно та зона, которая удовлетворяет этим требованиям в пределах нуклеотидных последовательностей генома данного вида. И, наоборот, в этих последовательностях должны быть как можно более существенные отличия среди всех близкородственных видов [189,190,191,192,193].
Среди множества различных направлений клинической диагностики ветеринарная микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода существенно расширило возможности современной практической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах. Hunt ML, Adler B, Townsend KM. в статье «The molecular biology of Рasteurella multocida» отмечают, что современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез, генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная картография, очень увеличили
наше понимание Pasteurella multocida, и предоставили исследователям много молекулярных инструментов для изучения патогенеза и эпизоотологии данного возбудителя на молекулярном уровне [194]. Учеными многих стран проводятся исследования по разработке различных методов ПЦР для идентификации штаммов Pasteurella multocida. Biswas A, Shivachandra SB, Saxena MK, Kumar AA, Singh VP, Srivastava SK. отмечают, что молекулярные методы выявления и типирования превосходят обычные методы исследований геморрагической септицемии [195].
Miflin JK, Blackall PJ., с целью разработки быстрого диагностического теста для идентификации Pasteurella multocida, разработали ПЦР анализ, используя праймеры полученные на последовательность гена 23 rRNA Pasteurella multocida. ПЦР исследование правильно идентифицировало все 144 исследованных изолята Pasteurella multocida, включая штаммы трех подвидов и референтные штаммы для типирования по схеме Heddleston и Carter. Из 20 проверенных близкородственных бактерий из семейства Pasteurellaceae только штаммы типа Pasteurella canis biovar 2 и Pasteurella avium biovar 2 были положительны. Эти две бактерии, прежде известные как Bisgaard Таксон 13, являются самыми близкими филогенетическими родственниками Pasteurella multocida, основанными на 16S рибосомальной рРНК. Все проверенные филогенетически несвязанные штаммы других возбудителей, выделенные от птиц и свиней, были отрицательны. Данный метод на основе ПЦР позволяет быстро идентифицировать колонии Pasteurella multocida птичьего или свиного происхождения. Авторы рекомендуют использовать данную модификацию ПЦР для быстрой и точной диагностики холеры домашней птицы и пастереллеза свиней [196].
Sellyei B, Varga Z, Ivanics E, Magyar T охарактеризовали и сравнили биохимическими тестами, методами капсульного типирования ПЦР и ERIC-ПЦР 61 штамм Pasteurella multocida, выделенные от различных видов птиц, представляющих различные географические области Венгрии. По результатам исследований, основанным на анализе группы штаммов, были выделены четыре большие и четыре минигруппы, которые показали значительную корреляцию с географическим происхождением и видом хозяина. Результаты их исследований показали, что ERIC-ПЦР может быть подходящей методикой для изучения адаптации Pasteurella multocida к хозяину и эпизоотологии возбудителя пастереллезов домашней птицы [197].
Saxena MK, Kumar AA, Chaudhari P, Shivachandra SB, Singh VP, Sharma B. оценивали применимость риботипирования основанного на 16S рРНК и 23S рРНК. Были риботипированы 48 изолятов Pasteurella multocida изолированных от различных хозяев и географических мест
Индии и один референтный изолят. Исследователями выявлено только четыре риботипа. Все изоляты, включая референтный от диких плотоядных животных, имели один и тот же риботип, хотя у них были различные серотипы. Один изолят от тигра имел дополнительную группу к представленным в главном риботипе группам. Изоляты от львов представляли два риботипа; из этих риботипов один (r2) имел дополнительную группу 3.6 kbp, которая отсутствовала во всех других риботипах. У второго риботипа (r4) от льва отсутствовала одна группа (6 kbp), которая присутствовала в другом риботипе. Изоляты были далее типированы, используя методы ERIC-ПЦР и REP –ПЦР, в результате чего были получены индексы дискриминации (D) 0.83 - 0.89. Данное исследование показало, что риботипирование не очень эффективный инструмент молекулярной эпизоотологии для видовой дифференциации изолятов [198].
Liu D, Lawrence ML, Austin FW. идентифицировали два гена - Pm0762 и Pm1231 - уникальных для P. multocida. Используя разработанные для этих генов олигонуклеотидные праймеры (Pm0762F/R и Pm1231F/R), получили специфичные продукты ДНК ожидаемых размеров только от геномной ДНК P. multocida. Результаты их исследований показали, что предполагаемые гены регуляторы транскрипции - Pm0762 и Pm1231 - являются специфичными для видов P. multocida и методы ПЦР, предназначающиеся для этих генов, обеспечивают быструю и точную идентификацию P. multocida от других бактерий; способствуют объяснению ролей и функций этих генов и их белковых продуктов, а также являются ценными для понимания молекулярного механизма вирулентности P. multocida [199].
Nagai S, Someno S, Yagihashi T. разработали ПЦР анализ для дифференцирования вирулентных штаммов Pasteurella multocida subsp. multocida от авирулентных штаммов на основе toxA гена. Был амплифицирован toxA ген, кодирующий 143-kDa дермонекротического токсина, который, как полагают, является центральным этиологическим фактором прогрессирующего атрофического ринита свиней. Полученные результаты ПЦР 187 областей ДНК изолятов P. multocida, были совместимы с результатами тестов на коже морских свинок и анализа иммуноблотинга [200].
Fisher MA, Weiser GC, Hunter DL, Ward AC. провели исследования методом ПЦР для определения леукотоксина lktA - структурного гена Pasteurella - в изолятах Pasteurella haemolytica и P trehalosi и коррелляции их бета – гемолитической деятельности с обнаружением lktA гена. Производство и секреция леукотоксина - главный фактор вирулентности, когда другие условия благоприятны для развития болезни. Было исследовано147 изолятов Pasteurella haemolytica от 21 биовариантных групп, и 101изолят Pasteurella trehalosi от 7
