При острых инфекционных болезнях, к которым относится и пастереллез, серологический диагноз имеет меньшее значение, чем такие методы диагностики, как бактериологический и биологический, так как болезнь протекает быстро. Но с целью своевременного и более полного выявления и в неблагополучных и в благополучных хозяйствах скрытых больных и животных-пастереллоносителей применение серологических реакций имеет большое значение.
Для серологической диагностики используют реакции агглютинации, связывания комплемента, преципитации, гемагглютинации, адсорбции агглютининов и другие.
Реакцию агглютинации (РА) пробовали применять для выявления птиц-пастереллоносителей, но отсутствие стандартных антигенов не позволяло дать объективную оценку этому методу диагностики, хотя S.Nomioka и M.Murata довольно успешно с помощью реакции агглютинации разделили соматические антигены на несколько групп. По различию в О-антигенном строении изученные 166 штаммов (выделенных от крупного рогатого скота – 26; свиней – 43; овец – 7; мышей – 18; кошек – 1; птиц – 69; человека - 2) были распределены на 10 групп. Группируя по соматическому и капсульному антигенам, все штаммы удалось разделить на 12 серологических типов (групп). В капсульную группу А входило пять соматических групп (1, 3, 5, 7 и 9), в группу Д – пять О-групп (1, 2, 3, 4 и 10) и одна из О-групп (6) была в группе В (G.R.Carter), к 12-му серотипу отнесены все остальные штаммы. На основании полученных данных авторы предлагают характеризовать штаммы P.multocida по соматическому и капсульному антигенам и в связи с этим именовать их 1:А, 3:А, 2:В и т.д. Штаммы 1:А и 3:А имеют общий капсульный антиген А, но различные (1 и 3) соматические антигены. Почти все культуры от цыплят и уток, больных пастереллезом, принадлежали к серотипу 5:А, от индеек - К 9:А. Несколько штаммов типа 2:Д были изолированы от цыплят при хроническом течении пастереллеза [48,92,70].
Большинство авторов ставили РА по обычно принятой методике, но антигены готовили по-разному, поэтому результаты, полученные с испытуемыми сыворотками птиц, были неодинаковыми.
S.Nomioka и M.Murata для постановки РА на стекле была предложена упрощенная методика. Антиген получали по особой методике – культуру пастерелл выращивали на УРС-агаре, предложенном авторами, причем рост был обильным, затем смывали формализированным буферным раствором. Типовые (эталонные) антисыворотки готовили по капсульному антигену штаммов А, В, С, Д по G.R.Carter. S.Nomioka и M.Murata применяли РА также для типирования пастерелл не только по капсульному антигену, но и по соматическому [48].
Применяется и реакция диффузионной преципитации (РДП), где для изготовления антигена К.П.Чепуров обрабатывается взвесь пастерелл в физиологическом растворе двукратным объемом хлороформа. А.Н.Борисенкова получала антигены из выращенной на МПА с 10% аминопептидом 2-суточной культуры пастерелл, смытых физиологическим раствором и прогретых в водяной бане при 56-580 С в течение 30 мин. После 20-минутного центрифугирования при 5000 об/мин супернатант был использован в качестве антигена [143,144]. Гипериммунные сыворотки получают путем иммунизации кроликов эталонными штаммами. Для этих целей используется та же методика гипериммунизации кроликов, как и в РА. Сыворотки и антигены в реакции использовали неразведенными, в эквивалентных объемах. Чашки Петри с реагентами помещали во влажную камеру при комнатной температуре, реакцию учитывали при постановке РДП в макромодификации в чашках Петри через 24-72 часа, а в микромодификации (на стеклянных пластинках 9 х 12) - через 18-24 часа. В обоих случаях использован агар Дифко [145].
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) в настоящее время считается наиболее точной серологической реакцией для выяснения иммунобиологического состояния. G.R.Carter применял ее для изучения иммунитета у птиц, иммунизированных против пастереллеза. Чаще она используется для идентификации различных серотипов пастерелл, имеющих капсулу. Реакцию ставят и учитывают по общепринятой методике в пробирках или на плексиглазовой пластинке с углублениями [146]. Метод иммуноферментного анализа (ИФА) был предложен в начале 70х годов тремя группами исследователей: Engvall и Perlmann в Швеции, van Weemen и Schuur в Нидерландах и Rubenstein с сотр. в США. К концу ХХ века этот метод прошел путь от новейшей научной разработки до рутинного метода в клинической диагностике. На сегодняшний день ИФА-диагностика является наиболее часто используемым диагностическим методом. В настоящее время в России и Казахстане для исследований на пастереллез животных используется набор для выявления антител к возбудителю пастереллеза (Pasteurella multocida) иммуноферментным методом фирмы «Synbiotics Europe» (Франция). Сущность ИФА пастереллеза, так же как и других болезней животных, заключается в специфическом взаимодействии антитела и антигена с последующим присоединением к полученному комплексу коньюгата (антивидового иммуноглобулина, меченого ферментом). Фермент вызывает разложение хромогенного субстрата с образованием окрашенного продукта, который выявляется либо визуально, либо фотометрически. Регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при определенной
длине волны. Результат выражают в единицах оптической плотности [147]. Существует множество вариантов постановки ИФА, из которых наибольшее практическое значение получил гетерогенный твердофазный иммуноферментный анализ. Использование твердой фазы позволяет упростить процесс разделения компонентов реакции за счет иммобилизации одного из компонентов на твердой фазе и удаления субстанций, не участвующих в реакции. Основными требованиями, предъявляемыми к твердой фазе при проведении ИФА, являются устойчивость к растворам, используемым в реакции, и высокая специфическая емкость (т. е. способности сорбировать на своей поверхности антитела или антигены в количествах, необходимых для проведения реакции в сочетании с как можно меньшей неспецифической сорбцией белков из исследуемых образцов и коньюгатов). Наиболее распространенным способом иммобилизации антител или антигенов является адсорбция, процесс, при котором часть молекул за счет ионных и гидрофобных взаимодействий, а также образования водородных связей, присоединяется к поверхности твердой фазы. В качестве твердой фазы в большинстве коммерческих диагностических наборов используют полистироловые 96-ти луночные планшеты или полистироловые шарики. В то же время метод ИФА в различных его модификациях мало эффективен в случае необходимости дифференциации типовой и штаммовой принадлежности микроорганизмов. ИФА выявляет белки-маркеры, являющиеся продуктами жизнедеятельности инфекционных агентов, что дает лишь опосредованное свидетельство наличия инфекции [148].
В последнее время, к традиционным микробиологическим и иммунологическим методам лабораторной диагностики инфекционных заболеваний животных добавились новые, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий.
К концу 90-х г. в микробиологической практике получило широкое развитие использование новых методических подходов, как в прикладном, так и фундаментальном аспекте. Среди них ведущее место заняли молекулярно-генетические методы - рестрикционный анализ, молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот, молекулярное клонирование. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике стало возможным в немалой степени благодаря созданию в середине 80-х годов процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция (ПЦР) [149,150].
Менее чем за 15 лет своего существования ПЦР сделала рутинным анализ специфических ДНК-последовательностей многих патогенных микроорганизмов. Универсальность, высокая чувствительность и
