относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для решения различных задач клинической диагностики, таких, как прямое обнаружение и идентификация возбудителей заболеваний, молекулярное типирование и исследование свойств патогенных микроорганизмов [151,152].
Основное преимущество этих методов, по сравнению с иммунологическими, состоит в возможности их использования при латентных и хронических инфекциях для широкого спектра патогенных микроорганизмов, а также определять генетическое родство возбудителей [153].
Молекулы ДНК разных микроорганизмов отличаются друг от друга содержанием пуриновых и пиримидиновых оснований, которые формируют комплементарные пары в антипараллельных цепях ДНК. Близкородственные микроорганизмы имеют идентичное или схожее содержание ГЦ-пар в ДНК, а далеко отстоящие в генетическом отношении сильно отличаются по относительному содержанию этих азотистых оснований.
Более тонким методом оценки генетического сходства организмов является метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, с помощью которого определяют число и степень сходства гомологичных участков в геномах сравниваемых видов [154].
В настоящее время наиболее приемлемой филогенетической системой классификации прокариот является система, основанная на сопоставлении последовательности нуклеотидов в 16 S РНК. Эта система положена в основу «Руководства по систематической бактериологии Берджи» 2001 года. По Берджи пастереллы относятся к Bacteria, Proteobacteria, Gammaproteobacteria, Pasteurellales, Pasteurellaceae, Pasteurella [90].
Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli принадлежат к γ подразделу протеобактерий, и включают очень много патогенных Гр- бактерий. Проведенный сравнительный анализ всего генома позволяет исследовать сравнительную эволюцию этих организмов в геномной лестнице. Установлено эволюционное родство между Pasteurella multocida, Haemophilus influenzae и Escherichia coli [155].
В 1985 году появилась первая статья, описывающая революционизирующую технологию - полимеразную цепную реакцию - ПЦР. Множественные (амплифицированные в миллион раз) копии определенных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью ПЦР. В настоящее время, метод ПЦР или специфической амплификации ДНК широко используется как для диагностики, так и для дифференциации различных групп микроорганизмов. ПЦР поднимает лабораторную диагностику на иной уровень определения ДНК или РНК, что позволяет
прямое обнаружение инфекционного агента или генетической мутации. Внедрение метода в лабораторную практику стало одним из наиболее важных событий в медицине и ветеринарии за последнее время. По данным журнала Labmedica International с 1995 г. наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста ее использования. В 1996 г. на ДНК-диагностику было потрачено 181.6 млн. долларов, а в 2002 г. затраты возросли до 1400 млн. долларов [156,157] .
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – искусственный процесс многократного копирования – амплификации, специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Копирование ДНК при ПЦР осуществляется специальным ферментом – ДНК-полимеразой , как и в клетках живых организмов. ДНК-полимераза, двигаясь по одиночной цепи ДНК (матрице), синтезирует комплементарную ей последовательность ДНК. Важно, что ДНК-полимераза не может начать синтез цепи ДНК "с нуля", ей необходима короткая "затравочная" цепь ДНК, к которой она может начать присоединять нуклеотиды. Существуют различные подходы к использованию ПЦР для диагностики возбудителей инфекций. Наиболее распространенный вариант ПЦР предусматривает использование праймеров, комплементарных специфической последовательности ДНК, характерной для строго определенного вида микроорганизмов (specific PCR). Имеется также возможность использования сразу нескольких пар видоспецифических праймеров в одной реакционной пробирке для одновременной амплификации ДНК различных возбудителей – множественная ПЦР (multiplex PCR) [158,159]. Множественная ПЦР может быть использована для выявления этиологической роли различных микроорганизмов, вызывающих заболевания определенного типа. В ветеринарной практике, точность ПЦР имеет меньшее значение в виду того, что ветеринарные инфекционисты работают с группами животных, в отличие от медиков. Поэтому для ветеринарии мультиплексные ПЦР перспективны не только для типирования культур микроорганизмов в процессе микробиологических исследований, но и для работы с патологическим материалом [160]. Альтернативный подход в ПЦР диагностике связан с использованием универсальных праймеров, которые позволяют амплифицировать фрагменты генов, присутствующих у всех микроорганизмов определенной таксономической группы: небольших (рода, семейства) или крупных таксонов на уровне порядка, класса, типа. В последнем случае мишенью для ПЦР чаще всего являются рибосомные гены (16S и 23S), которые имеют сходную структуру у различных прокариотических организмов. Полученные в
результате ПЦР фрагменты рибосомных генов могут быть затем идентифицированы молекулярными методами (секвенирование), чтобы сравнить амплифицированную ДНК с соответствующими последовательностями известных видов. [161,162,163,164,165]. На практике обычно используют менее трудоемкие и дорогостоящие методы, чем секвенирование которые, тем не менее, позволяют достоверно выявлять определенные различия в последовательности ДНК фрагментов. Наиболее распространенными являются методы, основанные на анализе расположения в ДНК участков расщепления ферментами-рестриктазами – метод ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов. ПЦР с использованием универсальных праймеров может применяться как для идентификации выделенных в чистой культуре микроорганизмов, так и для прямой диагностики широкого спектра возбудителей непосредственно в клинических образцах. Следует, однако, отметить, что чувствительность ПЦР «широкого спектра», как правило, ниже по сравнению с «видоспецифическими» тест-системами. Кроме того, ПЦР с универсальными праймерами обычно не используется для исследования образцов, в которых может находиться большое количество различных микроорганизмов, из-за трудности анализа продуктов реакции, полученных в результате амплификации ДНК разных видов [166,167,168]. ПЦР широко используется не только для идентификации, но также и для субвидового типирования и анализа генетического родства (клональности) выделенных штаммов микроорганизмов, особенно, при проведении эпизоотологических исследований. По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. На практике выбор определенного метода типирования зависит от характера и целей проводимого эпизоотологического исследования, с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации и т.д. Несмотря на разнообразие методов ПЦР-типирования, общим для большинства из них является использование гель-электрофореза для отдельного штамма. При этом сравнительный анализ индивидуальных электрофоретических профилей, проводимый визуально или с помощью компьютера, позволяет оценить степень генетического родства исследуемых штаммов [169,170,171]. Для визуализации результатов амплификации используют различные методы. Наиболее распространенным на сегодняшний день
