является метод электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру. Отрицательно заряженная ДНК начинает двигаться в геле от минуса к плюсу. При этом более короткие молекулы ДНК движутся быстрее, чем длинные. На скорость движения ДНК в геле влияет концентрация агарозы, напряженность электрического поля, температура, состав электрофорезного буфера и, в меньшей степени, ГЦ-состав ДНК. Все молекулы одного размера движутся с одинаковой скоростью. Краситель встраивается (интеркалирует) плоскостными группами в молекулы ДНК. После окончания электрофореза, продолжающегося от 10 мин до 1 часа, гель помещают на фильтр трансиллюминатора, излучающего свет в ультрафиолетовом диапазоне (254, 310 нм). Энергия ультрафиолета, поглощаемая ДНК в области 260 нм, передается на краситель, заставляя его флуоресцировать в оранжевокрасной области видимого спектра (590 нм). Яркость полос продуктов амплификации может быть различной. Поэтому часто в ПЦРлабораториях принято оценивать результат по трех-, четырех- или пятибалльной системе. Однако, как уже отмечалось ранее, это нельзя связывать с начальным количеством ДНК-мишени в образце. Часто уменьшение яркости свечения полос связано со снижением эффективности амплификации под влиянием ингибиторов или других факторов [172,173].
Метод вертикального электрофореза. Метод вертикального электрофореза принципиально схож с горизонтальным электрофорезом. Их отличие заключается в том, что в данном случае вместо агарозы используют полиакриламид. Его проводят в специальной камере для вертикального электрофореза. Электрофорез в полиакриламидном геле имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным электрофорезом и позволяет различать молекулы ДНК разных размеров с точностью до одного нуклеотида. Приготовление полиакриламидного геля несколько сложнее агарозного. Кроме того, акриламид является токсичным веществом. Поскольку необходимость определить размер продукта амплификации с точностью до 1 нуклеотида возникает редко, то в рутинной работе этот метод не используют . [174,175]
Другой способ детекции продуктов амплификации основан на гибридизации олигонуклеотидных зондов (искусственно синтезированных участков ДНК) с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными приборами. В этом случае чаще всего используют плашечный формат и систему детекции, аналогичную используемой в ИФА. Гибридизационные методы не получили пока широкого распространения из-за их дороговизны, длительности и трудоемкости методических манипуляций. Однако они интересны с точки зрения
массового скрининга, т.к. при наличии соответствующего оборудования могут быть легко автоматизированы [176,177,178,179].
Разработка праймеров для ПЦР является самым ответственным звеном в создании диагностикума. Требуется подобрать такой фрагмент молекулы ДНК, который бы отличался генетической консервативностью и присутствовал бы только у интересующего вида микроорганизмов или в исследуемом гене. При этом длина такого фрагмента должна составлять 15- 30 нуклеотидов. Проделать эту работу помогают специальные компьютерные программы, использующие информацию о нуклеотидной последовательности известных микроорганизмов или генов человека.
Дизайн праймеров (primer design) дословно с английского можно перевести как моделирование или конструирование праймеров. Сочетание из этих слов появилось вместе с тем, как была открыта полимеразная цепная реакция [180,181].
Дизайн праймеров – это не просто выбор праймеров. Сложность проводимой предварительной теоретической работы, связанной с дизайном праймеров, в значительной степени зависит от их дальнейшего назначения (применения). В ходе протекания полимеразной цепной реакции образуется продукт, называемый амплификатом. Амплификат содержит смесь ампликонов – основного, специфического, и побочных, неспецифических – отдельных продуктов реакции, отличающихся друг от друга длиной фрагмента (молекулярной массой). В идеале – это образование одного основного ампликона, который и является специфическим для выбранной пары праймеров [182,183,184,185,186,187].
Праймер, используемый в ПЦР, имеет специальное название – амплимер.
Конструирование праймеров проводится для решения одной из следующих задач:
1 Получение ПЦР-фрагмента, несущего видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для диагностики какого-либо заболевания (инфекционного или генетического); 2 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.) для клонирования в экспрессионный вектор или создания новых генетических конструкций;
3 Получение ПЦР-фрагмента, содержащего интересуемую нуклеотидную последовательность (ген, регуляторный элемент и т.п.) для последующего прямого секвенирования – определения первичной нуклеотидной последовательности – или для клонирования в вектор с целью последующего секвенирования;
4 Получение ПЦР-фрагмента, несущего родоили видоспецифическую нуклеотидную последовательность, для дифференциальной диагностики в пределах рода или таксона более высокого порядка; 5 Получение смеси специфических ПЦР-фрагментов в ходе проведения мультиплексной ПЦР для одновременной диагностики одного или нескольких заболеваний (инфекционных и/или генетических) [188]. Подбор эффективных праймеров – процесс эмпирический, соблюдение определенных требований увеличивает вероятность получения хороших праймеров: нужно выбирать праймеры с содержанием GC пар =50% и случайным распределением оснований. Следует избегать использования праймеров с протяженными полипуриновыми, полипиримидиновыми и другими неординарными последовательностями, а также последовательностей с устойчивыми вторичными структурами.
Необходимо поверять затравки на комплементарность друг другу, очевидно, что праймеры отжигающиеся с друг другом не смогут участвовать в амплификации интересующей нас последовательности.
Область отжига праймеров должна находиться вне зон мутаций делеций или инсерций в пределах видовой или иной, взятой в качестве критерия при выборе праймеров специфичности. При попадании на такую зону, отжига праймеров происходить не будет, и как следствие – ложноотрицательный результат. Иными словами, если предполагается разработать видоспецифический праймер на какой либо микроорганизм, выбирается именно та зона, которая удовлетворяет этим требованиям в пределах нуклеотидных последовательностей генома данного вида. И, наоборот, в этих последовательностях должны быть как можно более существенные отличия среди всех близкородственных видов [189,190,191,192,193].
Среди множества различных направлений клинической диагностики ветеринарная микробиология занимает, пожалуй, лидирующее место по количеству и разнообразию приложений, использующих технологию ПЦР. Внедрение в практику этого метода существенно расширило возможности современной практической микробиологии, основу которой до сих пор составляют методы выделения и культивирования микроорганизмов на искусственных питательных средах. Hunt ML, Adler B, Townsend KM. в статье «The molecular biology of Рasteurella multocida» отмечают, что современные молекулярные методы, такие как ПЦР, анализ ферментной рестрикции, риботипирование, пульс гель электрофарез, генное клонирование, характеристика и экспрессия рекомбинантных белков, мутагенез, анализ плазмид и бактериофагов и геномная картография, очень увеличили
