изучения видовых особенностей, воспроизводимости и отличительных особенностей, установления генетического родства штаммов Pasteurella multocida [222].

Метод ERIC-ПЦР может использоваться непосредственно для рутинного типирования изолятов, выделенных при вспышках пастереллезов домашней птицы и крупного рогатого скота. Методами nested ПЦР и ПЦР- ПДРФ (анализ рестрикции полиморфизма длин фрагментов) проводится серотипирование.

По сравнению с традиционными фенотипическими методами, генотипирование на основе ПЦР отличается универсальностью, более глубоким уровнем дифференциации, возможностью использования количественных методов для оценки идентичности штаммов и высокой воспроизводимостью. На практике выбор определенного метода типирования зависит от характера и целей проводимого эпизоотологического исследования, с учетом видовой принадлежности штаммов, их количества, источника выделения, требуемого уровня дифференциации и т.д. Несмотря на все преимущества методов ПЦР, классические методы исследования не утратили своего значения и при постановке диагноза на пастереллез должны учитываться, по мере необходимости, результаты бактериологических и серологических методов исследований.

Из вышеизложенных данных можно заключить, что для диагностики бактериальных инфекций в зарубежных странах внедряется метод ПЦР и его различные модификации. Понятно, что внедрение и владение подобными аналитическими методами молекулярной диагностики в практике эпизоотологии требует определенного финансирования и повышения профессиональной дисциплины и порядка в отрасли, но контроль, надзор и эпизоотический мониторинг состояния здоровья животных и внешней среды стоит того и обязывает ветеринарную науку и практику иметь и использовать современные точные экспресс-методы в своей деятельности [223]. Поэтому разработка, адаптирование и внедрение в ветеринарную практику в РК тест-системы (праймера) для диагностики пастереллеза крупного рогатого скота на основе ПЦР – требование сегодняшнего дня.

На основе анализа данных литературы, нами определены основные направления работы, а именно, изучение распространенности пастереллеза, определение биологических свойств возбудителя пастереллеза, разработка метода диагностики пастереллеза крупного рогатого скота на основе полимеразной цепной реакции.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы иследований

Исследования проводили в лаборатории «Молекулярной биологии и генной инженерии вирусов» НИИПББ НЦБ РК, лаборатории противобактериозной биотехнологи КазНАУ, НИЦ КГУ им. А. Байтурсынова, хозяйствах Костанайской и Алматинской областей.

Эпизоотическую ситуацию по пастереллезу сельскохозяйственных животных за 5 лет изучали по данным отдела ветеринарного надзора областного территориального управления МСХ РК, Костанайского областного филиала РГКП «Республиканская ветеринарная лаборатория», по результатам собственных исследований по диагностике пастереллеза крупного рогатого скота.

Для проведения экспериментальных работ исследовано 64 пробы патологического материала от 29 голов крупного рогатого скота из хозяйств в п. Прогресс, с/о Айдарлы, п. Челгаши Карасуского района, ТОО «Восток», АО «Север» Мендыкаринского района, ТОО «Викторовское» Тарановского района Костанайской области и СХПКП3 «Алматы -2» Алматинской области.

Всего было выделено 8 изолятов пастерелл, отобрано и подвергнуто всестороннему изучению биологических свойств 3 эпизоотических штамма пастерелл( К1,К2,А1) и 1 эталонный штамм Pasteurella multocida 90 из музея лаборатории противобактериозной технологии КазНАУ.

В лабораторных опытах использовано 35 белых мышей живой массой 16 – 18 г.

Для определения специфичности метода ПЦР при диагностике пастереллеза крупного рогатого скота использовали штаммы из коллекции лаборатории противобактериозной биотехнологии КазНАУ:

• штамм Pasteurella multocida 90, 26, 46

• штамм Escherichia coli

• штамм Salmonella dublin

• Salmonella typhimurium

• штамм Listeria monocitogenes

• штамм Brucella abortus

• штамм Mycobacterium bovis

В работе использовали питательные среды: МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера с добавлением 5% сыворотки крови лошади.

Среды и растворы.

В работе использовали следующие среды и растворы: 5 М NaCl, 3 M NaOH, 10 % БСА, 3 М ацетат натрия, 10 мМ дНТФ, 7 % уксусная кислота, 20 %, 30 %, 40 %, 60 % растворы сахарозы, 0,5 M ЭДТА, рН 8,0,

10 % ДСН, 10 мг/см³ этидиум бромида, 2 % ФВК, рН 6,8, 1 М KOH, 10 мг/см³ протеиназа К, 1 М Трис-HCl, рН 8,0, 96 % и 70 % этанол. TВE: 89 мМ Трис-борат, рН 8,0, 2 мМ ЭДТА

Оборудование:

• синтезатор олигонуклеотидов Expedite 8909, Applied Biosystems;

• термоциклер с градиентом температур Mastercycler gradient;

• УФ бокс UVS/ T-M, Латвия;

• РНК/ДНК калькулятор GenQuant Pro RNA/DNA Calculator,

• Amersham-Pharmacia-Biotech;

• аналитические весы AB 204-5/A, Mettler Toledo;

• рН-метр Delta 320 Mettler Toledo;