Диагностика пастереллеза крупного рогатого скота методом ПЦР

• универсальная цифровая система документации Infinity 115;

• термоплаты Thermomixer compact, Eppendorf;

• шейкеры, вортексы Vortex Genie 2 Shaker, МультиСпин MSС -

• 3000;

• автоматические микропипетки, Eppendorf;

• аппарат для горизонтального электрофореза нуклеиновых кислот

• HU 25, Scie - Plas;

• цифровой фотоаппарат для фотографирования гелей, Olympus;

• пакет прикладных программ для анализа последовательностей ДНК

• • DNASYS MAX 1.0, Sequencher, Vector NTI, BioEdit, GENEDOC, Staden package.

• рефрижираторная микроцентрифуга " Centrifuge 5417R", Eppendorf

• ;

• низкоскоростная центрифуга "Centrifuge 5702", Eppendorf;

• микроцентрифуга "MiniSpin", Eppendorf;

• ультразвуковой дезинтегратор "MSE-150", MSE;

• источник питания "Electrophoresis Power Supply-EPS 3501",

• Amersham-Pharmacia-Biotech.

Методы исследований.

Мониторинг эпизоотической ситуации по пастереллезу в Костанайской области проводили по данным ветеринарной отчетности Костанайской областной ветеринарной инспекции, Костанайского филиала РГКП «Республиканская ветеринарная лаборатория», результатам собственных исследований.

Выделение эпизоотических штаммов Pasteurella multocida проводили от больных и павших голов крупного рогатого скота из хозяйств Костанайской и Алматинской областей. Культурально - морфологические, биохимические, вирулентные свойства эпизоотических штаммов пастерелл изучали по общепринятым методикам.

Для выращивания культур штаммов пастерелл производили посевы на МПБ и МПА, питательные среды Хоттингера с добавлением 5% сыворотки лошади. Посевы инкубировали в термостате в течение 18 часов. Готовили суспензии из паренхиматозных органов, мазки из органов и крови сердца мышей, мазки из выращенных суточных культур. Мазки окрашивали по Граму, синькой Леффлера и по Романовскому - Гимза.

Биохимические свойства пастерелл изучали на средах Гисcа. Пастереллы расщепляли глюкозу, сахарозу, сорбит и маннит с образованием кислоты без газа, не разжижали желатин, образовывали индол.

Выделение ДНК из бактериальной культуры Pasteurella multocida проводили обработкой протеолитическим ферментом – протеиназой К.

В суточную культуру возбудителя добавляли протеиназу К до конечной концентрации 100 мкг/см³ , ДСН до конечной концентрации 0,5 %. Полученную смесь инкубировали при 56⁰ С в течение 1 ч, при этом происходил лизис и выделение ДНК.

ДНК очищали двукратным экстрагированием равными объемами фенола и фенол/хлороформа. Каждую экстракцию проводили медленным переворачиванием пробирки. Фенольную и водную фазы разделяли центрифугированием при 15600 g, при комнатной температуре в течение 5 мин на центрифуге "Eppеndorff''. Конечную водную фазу отбирали и экстрагировали равным объемом смеси хлороформ/изоамиловый спирт (96:4). Водную фазу отбирали и к ней добавляли 1/10 объема 3 М ацетата натрия и 2,5 объема охлажденного 96 % этанола. Смесь тщательно перемешивали и выдерживали при минус 20⁰ С в течение 1 ч.

Осаждение ДНК проводили центрифугированием при 15600 g в течение 15 мин при температуре 4⁰ С. Осадок ДНК дважды промывали 70 % этанолом, высушивали на воздухе и растворяли в необходимом объеме ТЕ буфера.

Чистоту полученных препаратов ДНК определяли спектрофотометрически по отношению оптических плотностей при длинах волн 260 нм и 280 нм (Е260/Е280). Для чистых препаратов ДНК это отношение должно быть равно 1,8 и выше. Если это отношение меньше, значит, препараты загрязнены белками или фенолом. В этом случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию фенол/хлороформом.

При выделениеи ДНК Pasteurella multocida из органно-тканевых материалов образцы исследуемого биологического материала (легкие, лимфоузлы) мелко нарезали с помощью скальпеля и помещали в ступки с песком. Материал растирали до образования однородной массы, и добавляли физиологический раствор для получения 20 % суспензии (вес/объём). Далее выделение бактериальной ДНК проводили по выше описанной методике.

Кровь для исследования консервировали 3% раствором трилона Б. При перхлоратном методе цельную кровь в первый день ставили на лизис:

• на 200 мкл цельной крови добавили 1 мл ТЕ буфера и перемешивали в течение 1 минуты на вортексе, затем центрифугировали при 7500 об/мин в течение 1 минуты. Затем супернатант сливали так повторяли 2-3 раза, до получения супернатанта розового цвета; аккуратно сливали верхний слой и добавляли 300 мкл лизирующего буфера и 8 мкл. протеиназы К; ставили в термостат при +63⁰ С на 12-14 часов. На следующий день для продолжения процесса выделения ДНК в каждую пробирку добавляли реагенты: 50 мкл перхлората натрия и

мешали на шейкере около 5 минут; 300 мкл CIA, мешали на шейкере около 5 минут; центрифугировали 15 об/мин в течение 1 минут; верхнюю фракцию после разделения сред снимали дозатором и добавляли 600 мкл 96⁰ С этилового спирта, встряхивали пробирку, в результате ДНК выпадает в осадок; сливали спирт и добавляли 600 мкл охлажденного 70⁰ С спирта и оставляли на 15 минут; спирт сливали и ставили пробы ДНК сушить. Затем в высохшие пробирки с ДНК добавляли 60 мкл бидистиллированной воды.

Метод щелочного лизиса осуществлялся по следующей схеме:1мкл лейкоцитов крови помещали в 0,5 мл пробирку, затем дабавляли 10 мкл щелочного лизисного буфера ALL. Пробы инкубировали при +60⁰ С в течение 30-45 минут. Лизат охлаждали и центрифугировали несколько секунд при 15 тыс. об/мин для осаждения конденсата. Затем добавляли 10 мкл нейтрализационного раствора NL и тщательно перемешивали. Далее центрифугировали в течение 1 минуты при 15 тыс. об/мин для осаждения

Для выделения бактериальной ДНК также использовали набор – DNA Genomic Extraction Kit фирмы "Sigma", в соответствии с прилагаемой инструкцией к набору.

Рестрикционный анализ препаратов ДНК бактерии Pasteurella multocida проводили, используя ферменты рестрикции, а именно Apa I, Ceu I, NotI.

В одной пробирке смешивали 10 мкл ДНК бактерии, 7 мкл H2O, 2 мкл 10х буфера (для каждой рестриктазы использовали соответствующий ей буфер, который прилагался к набору с рестриктазами фирмы " Sigma") и 1 мкл рестриктазы (10 ед/см³ ). Смесь инкубировали при 37⁰ С в течение 2 ч и разделяли компоненты электрофорезом в 0,7 % агарозном геле.

Электрофоретический анализ рестрикционных фрагментов ДНК провордили на электрофоретическом аппарате HU 25, Scie - Plas;

Электрофорез проводили при напряжении 5 В/см, при температуре 4⁰ С в течение ночи. Для электрофореза использовали 0,7 % раствор агарозы в ТАЕ-буфере с бромистым этидием в концентрации 1 мг/см³ .

В качестве контроля использовали ДНК фага λ, обработанную рестриктазой Hind III (DNA Molecular Weight marker II (0,12-23,1 kbp). Документировали полученные результаты через трансгельиллюминатор, с помощью компьютерной программы "LabWorks 4.0", определяли молекулярные массы рестриктов, сумму всех фрагментов рестрикции.

Синтез подобранных праймеров осуществляли на синтезаторе нуклеотидов "Expedite 8909" фирмы "Applied Biosystems" согласно протоколам, прилагающимся к прибору. Полученные олигонуклеотиды элюировали с колонок концентрированным раствором аммиака и выпаривали в вакуумном испарителе CentriVap Concentrator,