Cu** или обработанные сверхвысокочастотными волнами (СВЧ) и ультразвуком (УЗ). При этом в каждый из контейнеров «искусственного рубца» вносили по 128 мл рубцовой жидкости и 500 мг трофического субстрата и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С. Временной интервал отбора проб составлял 3, 6, 12, 24ч.
| Таблица 58 - Схема искусственного рубца | |
|---|---|
| $+СВЧ |
где Ко - модельная рубцовая жидкость; К — реальная рубцовая жидкость; $+Са - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Са?; S+Cr - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Сг;, StFe - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Ее”; S+Cu - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Си?*, $+СВЧ - пшеничные отруби, обработанные СВЧ; $+У3 - пшеничные отруби, обработанные УЗ. После 24 часов инкубации в условиях «искусственного рубца», отделяли рубцовую жидкость от субстрата и от бактерий центрифугированием в течение 10 минут и формировали жидкость, в которой определяли возможное присутствие токсиканта. Для изучения интегральной биотоксичности рубцовой жидкости и ее отдельных компонентов (пропионовой, молочной, масляной, уксусной кислот, глюкозы и 10% водного раствора аммиака в физиологических концентрациях) использовали люминесцирующий штамм «Эколюм», который восстанавливали из лиофилизированного состояния путем добавления 10 мл дистиллированной воды, после чего выдерживали флакон в течение 30 минут при 4 °С, после чего формировали смесь в лунках планшета, состоящую из 225 мкл испытуемого агента и 25 мкл бактерий. Измерение свечения проводили на люминометре в ве‘отдельныхДля изучениякомпонентов дифференциальной использовали биотоксичностирепортерные штаммы рубцовойЕ.сой Жилкости fabA::lux,и E.coli ibpA::lux, E.coli тесА:Лих и E.coli саа: их, при этом суточную культуру, ресуслендироваливыращенную на LB-arapeв ГВ-бульонес ампициллиноми подращиваливв течениеконцентрации2 часов100при мкг/мл37 °С, после чего штаммы трехкратно отмывались в физиологическом растворе. Далее формировали смесь в лунках планшета, состоящую из 225 мкл испытуемого агента и 25 мкл бактерий. Измерение свечения проводили на люминометре в кинетическом режиме в течение 120 мин. Уровень биолюминесценции бактериальных штаммов выражали в единицах биолюминесцентного индекса (БЛИ), рассчитанного по формуле:
БИ =
Е где i" — уровень люминесценции опытной пробы на п-минуте; i — уровень люминесценции опытной пробы на 0-минуте; om — уровень люминесценции контрольной пробы на п-минуте; 1°" — уровень люминесценции контрольной пробы на 0-минуте. были использованыВ качестве базового«Искусственныйоборудованиярубец»дляКРГ.-01 проведения[175],исследованийлюминометр намиLMОТТ (immunotech, Чехия), рН-метр-иономер Эксперт-001 (Эоникс-Эксперт. Россия), центрифуга лабораторная CM-6M (Элми, Россия). у Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета компьютерных программ «Statisticay V9 («StatSoft Inc.», США). При оценке соответствия параметров биотоксичности. полученных с использованием различных сенсорных микроорганизмов, 1 использован модуль «Корреляционный анализ».
=171Изучениенормальногокомпонентного состава рубцовой жидкости и установление его влияния на уровень свечения биосенсора
Рассматривая вопрос об уровне токсичности рубцовой a входящих в ее состав отдельных компонентов, в первую оче им fs и оценена степень их интегральной токсичности = Ню г ыла и Е сенсорногополученная штаммаиз рубцаE.coliкрупного«Эколюм-9». АТ: aie eaeбцовая жидкость, О aaa a,ee ны о. характеризующееся резким тушением свечения уже в первые минуты = x (рисунок 24). Эффект объясняется наличием высокой конце aнтрации ионовакта овызывающих опротонирование молекуло naИwekohensАКGackи —— a. транспорт веществ и активность дыхательных ферментов. В can: нарушает была создаца Моделеная рУбщовая жидкость we> щаяд собойA Hemкомплекс нами aaных источников азота и углерода.
та
7
1,4 ig
12 : i
|
д be
— al ee |
Е
0,6 ‘ Е яA | 4
В р Г. р ]
nee 9 hee ne = - wey a
02]р № р я г р р i ie
— В й ‘ i : [a a Ls S|
МЕ: Е а = ще. Е
8 8 23 ЗЕ g 8 Е 8 В Е 3 Е
БЕ ge Е g ee ЗЕ ae . <
Я &
Рисунок 24 — Оценка интегральной биотоксичности рубцовой жидкости и ее
отдельных компонентов с использованием сенсорного штамма E.coli
Действие полученной смеси носило аналогичный характер при
сопоставлении с рубцовой жидкостью, однако проявляла меньшую степень
токсичности в отношении бактериальных клеток, что связано, по всей
видимости, с отсутствием в ее составе полного спектра веществ, включая
ферменты и антимикробные пептиды.
Последующие эксперименты были проведены с целью
дифференцировать компоненты рубцовой жидкости, ‚оказывающих наиболее
Oe pa НЕ ee ae
органическиене оказываюткислотывлиянияв физиологическихна интенсивность концентрацияхсвечения бактериальныхв большинствеклеток,своем
однакоруксусная ae senda aepe ome CIES Gua
тушения люминесценции бактерий, что обусловлено протонированием
мембраныстороны, глюкозаи нарушениемоказывалаобменастимулирующийаминокислот,эффектсоответственно.ввиду использованияС другой
данного вещества как типичного субстрата для метаболизма клетки.
Дальнейший анализ действия компонентов рубцовой жидкости был направлен
на изучение механизма их влияния на бактериальные клетки, что возможно
благодаря репортерным штаммам, у которых специфичные к различным стресс-
факторам промоторы клонированы перед /ихСРАВЕ генами, таким образом, об
их активации можно судить по степени увеличения люминесценции.
Использование штамма E.coli fabA::/ux, в котором использованный промотор
отвечает за синтез З-гидроксидеканоил-КоА дегидразы, представляющего
собой ключевой фермент реакций биосинтеза жирных кислот мембраны,
позволило идентифицировать уксусную кислоту как наиболее сильный
135
