- Выбор и обоснование оптимального варианта направления исследования биологической активности и механизмов действия интегральной биотоксичности рубцовой жидкости и ее отдельных компонентов с использованием бактериальных люминесцирующих тестсистем
coli K12В качествеТОТ, конститутивно объекта воздействияэкспрессирующийиспользован/ихСРАВЕ-генырекомбинантныйприродного штамм Е. морского люминесцирующего микроорганизма P.leiognathi, выпускаемый HBO «Иммунотех» (Россия) в лиофилизированном состоянии под коммерческим названием «Эколюм» и рекомендуемый для заявленных целей действующим национальным нормативом. Непосредственно перед проведением исследований данный препарат восстанавливали добавлением 10 мл охлажденной дистиллированной воды, выдерживали при +2-4 °С в течение 30 мин, после чего доводили температуру бактериальной суспензии до +15-25 °С. Дальнейшая процедура биотестирования включала три основных этапа: приготовление суспензий анализируемых соединений, их смешивание и совместную инкубацию с сенсорным микроорганизмом, а также количественное измерение биолюминесценции, сравнение интенсивности которой с контрольными значениями позволяло проводить расчет соответствующих токсикологических параметров. 54Р10E.coli К12При ТС1проведениис клонированнымиисследований[их СРАВЕиспользовангенами Photobacteriumрекомбинантныйleiognathiштамм [37], выпускаемый в виде лиофилизированного препарата под коммерческим названием «Эколюм-9» (НВО «Иммунотех», Москва), а также серия репортерных микроорганизмов с индуцибельной экспрессией /ux-renos, клонированных под различными промоторами (табл. 57) Таблица их-генами 57 — Особенности промоторов репортерных штаммов, сшитых с З-тидроксидеканоил-КоА-дегидраза Щаперон ИЕ Регуляторныйбелок IbpARecA- Повреждение. белков __ активатор SOS-orsera ЕАК Tag rau D
Объектами рогатого скота казахскойисследованиябелоголовойявиласьпороды;рубцоваямодельнаяжидкостьрубцоваямясногожидкость,крупного полученная на основе фосфатного буфера, пропионовой, молочной, масляной, уксусной кислот, глюкозы и 10-% раствора аммиака; трофические субстраты на основе пшеничных отрубей, экструдированных с добавлением Са?, Сг, Fe?*,
Cu** или обработанные сверхвысокочастотными волнами (СВЧ) и ультразвуком (УЗ). При этом в каждый из контейнеров «искусственного рубца» вносили по 128 мл рубцовой жидкости и 500 мг трофического субстрата и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С. Временной интервал отбора проб составлял 3, 6, 12, 24ч.
| Таблица 58 - Схема искусственного рубца | |
|---|---|
| $+СВЧ |
где Ко - модельная рубцовая жидкость; К — реальная рубцовая жидкость; $+Са - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Са?; S+Cr - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Сг;, StFe - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Ее”; S+Cu - экструдированные пшеничные отруби с добавлением Си?*, $+СВЧ - пшеничные отруби, обработанные СВЧ; $+У3 - пшеничные отруби, обработанные УЗ. После 24 часов инкубации в условиях «искусственного рубца», отделяли рубцовую жидкость от субстрата и от бактерий центрифугированием в течение 10 минут и формировали жидкость, в которой определяли возможное присутствие токсиканта. Для изучения интегральной биотоксичности рубцовой жидкости и ее отдельных компонентов (пропионовой, молочной, масляной, уксусной кислот, глюкозы и 10% водного раствора аммиака в физиологических концентрациях) использовали люминесцирующий штамм «Эколюм», который восстанавливали из лиофилизированного состояния путем добавления 10 мл дистиллированной воды, после чего выдерживали флакон в течение 30 минут при 4 °С, после чего формировали смесь в лунках планшета, состоящую из 225 мкл испытуемого агента и 25 мкл бактерий. Измерение свечения проводили на люминометре в ве‘отдельныхДля изучениякомпонентов дифференциальной использовали биотоксичностирепортерные штаммы рубцовойЕ.сой Жилкости fabA::lux,и E.coli ibpA::lux, E.coli тесА:Лих и E.coli саа: их, при этом суточную культуру, ресуслендироваливыращенную на LB-arapeв ГВ-бульонес ампициллиноми подращиваливв течениеконцентрации2 часов100при мкг/мл37 °С, после чего штаммы трехкратно отмывались в физиологическом растворе. Далее формировали смесь в лунках планшета, состоящую из 225 мкл испытуемого агента и 25 мкл бактерий. Измерение свечения проводили на люминометре в кинетическом режиме в течение 120 мин. Уровень биолюминесценции бактериальных штаммов выражали в единицах биолюминесцентного индекса (БЛИ), рассчитанного по формуле:
БИ =
Е где i" — уровень люминесценции опытной пробы на п-минуте; i — уровень люминесценции опытной пробы на 0-минуте; om — уровень люминесценции контрольной пробы на п-минуте; 1°" — уровень люминесценции контрольной пробы на 0-минуте. были использованыВ качестве базового«Искусственныйоборудованиярубец»дляКРГ.-01 проведения[175],исследованийлюминометр намиLMОТТ (immunotech, Чехия), рН-метр-иономер Эксперт-001 (Эоникс-Эксперт. Россия), центрифуга лабораторная CM-6M (Элми, Россия). у Полученные результаты обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета компьютерных программ «Statisticay V9 («StatSoft Inc.», США). При оценке соответствия параметров биотоксичности. полученных с использованием различных сенсорных микроорганизмов, 1 использован модуль «Корреляционный анализ».
=171Изучениенормальногокомпонентного состава рубцовой жидкости и установление его влияния на уровень свечения биосенсора
Рассматривая вопрос об уровне токсичности рубцовой a входящих в ее состав отдельных компонентов, в первую оче им fs и оценена степень их интегральной токсичности = Ню г ыла и Е сенсорногополученная штаммаиз рубцаE.coliкрупного«Эколюм-9». АТ: aie eaeбцовая жидкость, О aaa a,ee ны о. характеризующееся резким тушением свечения уже в первые минуты = x (рисунок 24). Эффект объясняется наличием высокой конце aнтрации ионовакта овызывающих опротонирование молекуло naИwekohensАКGackи —— a. транспорт веществ и активность дыхательных ферментов. В can: нарушает была создаца Моделеная рУбщовая жидкость we> щаяд собойA Hemкомплекс нами aaных источников азота и углерода.
