- Оценка влияния крахмалосодержащих субстратов in vitro и in situ на рубаовое пищеварение: характеристики бактериальных люминесцирующих тест-систем; переваримость кормов.
Увеличение эффективности использования кормовых средств является одной из важных задач животноводства. В частности, активное включение большого количества концентрированных кормов на стадии доращивания и откорма, может спровоцировать возникновение заболеваний, связанных с нерациональным кормлением. Так, кормление животных зерном (особенно дробленным), которое быстро ферментирует, вызывает резкое снижение PH рубцовой жидкости и возникновение субострого и острого ацидоза, что в итоге снижает кормовую эффективность. В мировой практике для решения данной проблемы используются вещества, способствующие амортизации кислотной среды в рубце (ионофоры, ыы бикарбонаты и др.). Однако конечный эффект монензина Ha микро НЫЕ iae) (LD CEE ED) EC REIT CEL дополнительных исследований (Weimer et al., 2008). Так использование монензина привело к повышению микробного синтеза белка и азота в кормлении овец на высококонцентратных рационах и происходит это Ес снижения числа простейших в рубце (Rogers et al., 1997; Garcia et al., 2000). HioHOG0 DEI Ocak щи кормовыеЖантионотики кисполезузмыедиеуканестве ae eeщеOR Nae aera Ea баки эфирные масла из растений получают значительное внимание в качестве альтернативы, способствующих росту рубцовых модификаторов с момента введения запрета на использование антибиотиков в pong’ant tata добавок (Сабапивна et al., 2007), но результаты должны а ыы. ие = Me У словнями psa и и. исследований. Исследования in vitro проводились с использованием «искусственного» рубца методом нейлоновых мешочков, время инкубирования ~ 3 часа. При проведении лабораторных исследований = A использован рекомбинантный штамм E.coli К12 ТС1 с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi 54010, а также серия репортерных микроорганизмов © индуцибельной экспрессией 1их-генов, клонированных под различными промоторами. Объектами исследования явилась рубцовая жидкость крупного рогатого скота; трофические субстраты — измельченное зерно ячменя (Hordeum vulgare), пшеницы (Triticum aestivum), ржи (Secdle сеге&е) и их сочетаний. Схема эксперимента предусматривала приготовление навесок: ячмень (Н) — 100 mr, рожь (5) — 100 мг, пшеница (Т) — 100 мг, смесь — Н + $ по 50 мг, смесь — Н + $ по 35 и 65 мг, смесь -— Н + $ по 25 и 75 мг. Далее навески были помещены в пробирки, в которые внесено по 1 мл рубцовой жидкости. Полученные смеси инкубировали в термостате при 37 °С с экспозицией 3 часа.
Для изучения активности рубцовой жидкости использовали люминесцирующий штамм «Эколюм», который восстанавливали из лиофилизированного состояния путем добавления 10 мл дистиллированной воды, после чего выдерживали флакон в течение 30 минут при 4 °С. В лунках планшета были серийно разведены физиологическим раствором инкубированные образцы. Объем жидкости в каждой лунке составил 100 мкл. Во все лунки внесено по 100 мкл восстановленного «Эколюма», таким образом, соотношение анализируемого субстрата и биосенсора составило 1:1. Свечение измеряли 60 минуг на пюминометре. Уровень биолюминесценции бактериальных штаммов выражали в единицах биолюминесцентного индекса (БЛИ), рассчитанного по формуле:= yon, ен oe ome где !>””=. — уровень люминесценции опытной> пробы Ha п-минуте; wen уровень люминесценции опытной пробы на 0-минуте; тр | = — уровень люминесценции контрольной пробы Ha п-минуте; 0 — уровень люминесценции контрольной пробы на 0-минуте.
В качестве базового оборудования для проведения исследований были использованы «Искусственный рубец» KPL-01, люминометр LM-01T (Immunotech, Чехия), рН-метр-иономер Эксперт-001 (Эоникс-Эксперт, Россия), центрифуга лабораторная СМ-6М (Элми, Россия). Экспериментальная часть исследований состояла из физиологического эксперимента, который проводился на фистулированных бычках красной степной породы, в условиях физдвора Покровского сельскохозяйственного колледжа Оренбургского района Оренбургской области. В назале подготовительного периода подопытным животным по методу А.А. Алиева (1998) были установлены фистулы рубца. В течение подготовительного периода эксперимента бычки были переведены на привязное содержание, индивидуальное кормление, на рационы составленных на основе детализированных норм кормления разработанных А.П. Калашниковым и др. (2003). В течение опыта рацион для подопытных животных были сбалансированырассчитанным Haпо получениеосновным 800-900питательнымг среднесуточноговеществам согласнопривеса.нормам,Для определения переваримости крахмала в рубце использовался метод in situ или так называемый метод «нейлоновых мешочков» (Григорьев Н.Г., 1989). Мешочек с 5 г навески корма помещали в рубец: с концентрированными кормами на 3 часа. Химический состав кормов изучался по методикам ы биохимических исследований согласно‘ требованиям ГОСТа, в условиях центра коллективного пользования научным оборудованием Всероссийского НИИ мясного скотоводства (аттестат аккредитации испытательного центра №РОСС RU 0001.21 1459 от 19.05.2011).
Основные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием программ «Excel», «Statistica 10.0». Достоверными считали различия при р<0,05. Результаты исследований. При контакте нативной рубиовой жидкости с сенсорными люминесцирующими бактериями E.coli было зарегистрировано дозозависимое ингибирование свечения в первые секунды контакта (рис.17). При этом ко второй минуте контакта «тушение» составило до 5,20 + 0,59 % в случае с исходной средой и убывало в ряду двухкратных разведений до 102,56 + 4,83 % при титре 1:1024. После 30 минут инкубации смеси уровень свечения в пробе с нативной рубповой жидкостью достигает контрольного и с течением времени повышается до 190,59 = 22,15 % после 60 минут контакта. Штамм E.coli katG::lux, в котором клонированный промотор отвечает за синтез каталазы, обеспечивающей — нейтрализацию пероксида — водорода, продемонстрировал индукцию свечения, достигаемую 3,0 относительных единиц на 60 минуте контакта. Изучение генотоксических эффектов, основанное на активации белков системы репарации RecA/LexA с использованием штамма E.coli recA::lux, позволило зарегистрировать эффекты индукции свечения данных бактериальных клеток при контакте с нативной рубцовой жидкостью (рис. 18).
м“ ы
р д 3 ы
в
'
i wo &
zoe Е
Е 8 В
2“ з
. 8
Ca р
°2 4
° © 1024 512 Cremens255 разведении18 рубловойokжадкосты о
т Рис. 17 Уровень люминесцентногоотклика сенсорныхштаммов Ё.сой на2 (А) ибо (B) минуте контакта с различными титрами рубцовой жидкости
р
