та
7
1,4 ig
12 : i
|
д be
— al ee |
Е
0,6 ‘ Е яA | 4
В р Г. р ]
nee 9 hee ne = - wey a
02]р № р я г р р i ie
— В й ‘ i : [a a Ls S|
МЕ: Е а = ще. Е
8 8 23 ЗЕ g 8 Е 8 В Е 3 Е
БЕ ge Е g ee ЗЕ ae . <
Я &
Рисунок 24 — Оценка интегральной биотоксичности рубцовой жидкости и ее
отдельных компонентов с использованием сенсорного штамма E.coli
Действие полученной смеси носило аналогичный характер при
сопоставлении с рубцовой жидкостью, однако проявляла меньшую степень
токсичности в отношении бактериальных клеток, что связано, по всей
видимости, с отсутствием в ее составе полного спектра веществ, включая
ферменты и антимикробные пептиды.
Последующие эксперименты были проведены с целью
дифференцировать компоненты рубцовой жидкости, ‚оказывающих наиболее
Oe pa НЕ ee ae
органическиене оказываюткислотывлиянияв физиологическихна интенсивность концентрацияхсвечения бактериальныхв большинствеклеток,своем
однакоруксусная ae senda aepe ome CIES Gua
тушения люминесценции бактерий, что обусловлено протонированием
мембраныстороны, глюкозаи нарушениемоказывалаобменастимулирующийаминокислот,эффектсоответственно.ввиду использованияС другой
данного вещества как типичного субстрата для метаболизма клетки.
Дальнейший анализ действия компонентов рубцовой жидкости был направлен
на изучение механизма их влияния на бактериальные клетки, что возможно
благодаря репортерным штаммам, у которых специфичные к различным стресс-
факторам промоторы клонированы перед /ихСРАВЕ генами, таким образом, об
их активации можно судить по степени увеличения люминесценции.
Использование штамма E.coli fabA::/ux, в котором использованный промотор
отвечает за синтез З-гидроксидеканоил-КоА дегидразы, представляющего
собой ключевой фермент реакций биосинтеза жирных кислот мембраны,
позволило идентифицировать уксусную кислоту как наиболее сильный
135
легергеит в отношении фосфолинидных группировок (рис. 25), а также аммиак, для которых уровни индукции свечения составляли 4,2 и 2,7 относительных единиц.
0
©
87 =г3
Я
=. Е _
С р | = Ey
3 = Е | >
Я В fl Е SS Fe
ЗЕ 5 5 Be 5 Se g Е
ВЕ 48 68 gf 88 88 Я Е
Е
Рисунок 25 — Оценка дифференциальнойOfabA МЪРА биотоксичности GrecA (4 сда рубцовой жидкости и
ее отдельных компонентов с использованием панели репортерных штаммов
С другой стороны, использование штамма E.coli ibpA::lux, в которой специфический промотор отвечает за синтез шаперона теплового штока, связывающего белки и облегчающего их последующий рефолдинг АТФзависимыми шаперонами, не позволило зарегистрировать каких либо значительных эффектов.ФФ И,Конаконец, изучениEy с эффектов поврежденияе ДНК, основанное на активации белков системы репарации RecA/LexA с использованием штамма E.coli. recA::lux выявило значительные эффекты НОиндукциия свечениячеOo ть itaданныхer anбактериальных5 eineм ees aeклеток‘al приаммиаком. pyом aay'РЯСНЕНИЕМ уксусной, —_изменять ipaродасGana aninnДНК asс na аллельным cno6o о ры закислением2х Weорг:aWe циткихeenкислот Що SEE EET Ee ie =Енi,. к ве ие oro) м Ta ea ee (HOHHO a =е! CIEE ABIOETIO, Е стороны, для штамма E.coli cda::lux подобных эффектов
17.2 Определение оптимальных условий для биохемилюминесцентной оценки жизнедеятельности рубцовых микроорганизмов, под воздействием кормового фактора с использованием люминесцирующих микроорганизмов in vitro. альнейшие исследования были авлены на изучениеуч влияния кормового фактора Ha возможные механизмы биотоксичности рубцовой жидкости в Уусловиях искусственного бца. Прир этом были оценены э екты различных катионов металлов, а также физических способов обработки кормов с различными интервалами экспозиции рубцовой жидкости с кормовым фактором В первую очередь было оценено влияние времени инкубации рубцовой жидкости в искусственном рубце на характер ответа люминесцирующих бактерий после 30-минутного контакта (рис. 26).
be2 52est Я . Ех
Е Be Ge ray pe BR RS es
Е Wake > ян Gers Ze RY Е 5 VA:4
Ё Й =| Ze Be я gas ge ee EB ge
rt Be Bs Bes ge й В Ав A ks
Е ge A й. я ZS АВ ges Be
Bs ge ge АЯ gs Ze ge
LE | eS | a a Aisi | aks | aks
к 5+Са 5+Сг S+Fe S+Cu S+CBY St¥3
Оч 6 ч 8 12ч 8244
Рисунок 26 — Влияние времени инкубации Я и дополнительныхit кормовых факторов на уровень интегральной токсичности рубцовой жидкости
Установлено, что для рубцовойИ жидкости практически не изменяется степень токсичности, причем с течением времени она снижается, что проявляется в уменьшении ингибирующего влияния на биолюминесценцию бактериальных клеток и даже увеличения уровня их свечения. Однако добавление в трофический субстрат элементов в форме двухвалентных металлов, а также использование дополнительных физических способов обработки значительно меняло картину люминесцентного отклика микроорганизмов. Так, ионы железа на шести часах инкубации резко увеличивали уровень токсичности смеси, что проявлялось в снижении свечения бактерий на 23,8%, по сравнению с той же системой трехчасовой инкубации. Подобные эффекты связаны со способностью двухвалентного железа запускать формирование различных активных форм кислорода (реакция Фентона), при 137
