исходной изучаемой жидкости позволяло зарегистрировать еще большую стимуляцию люминесценции биосенсоров, при титре Е достигающую пиковых значений и составляющую 1223,52 + 119,58 % от контрольных. Дальнейшее разведение вплоть до 1:1024 не дает дополнительной стимуляции свечения, параллельно не оказывая ингибирующее воздействие в первые минуты контакта. С другой стороны, проведение дополнительной процедуры центрифугирования рубцовой жидкости при 10008 в течение 15 минут с целью осаждения взвешенных частиц не привело к значимым изменениям получаемых результатов и позволяет рекомендовать проводить оценку данной биологической жидкости в исходном нативном состоянии.
Полученные данные по оценке общей токсичности характеризуют рубцовую жидкость как достаточно благоприятную среду для роста бактерий, несмотря на первоначальное дезинтеграционное воздействие на бактериальные клетки. Это обеспечивается обилием питательных субстратов различного уровня ферментации в данной среде, включая даже такой легкодоступный метаболит как глюкоза.
Дальнейшие исследования были направлены на выявление характера воздействия рубцовой жидкости на бактериальные клетки и выяснения особенностей ответа клеток. В таком случае, если в среде присутствует фактор активации специфического промотора, интегрированного непосредственно перед [ихСРАВЕ генами, начинается экспрессия последних, что отражается увеличениеммеханизмов воздействиясвечения. В нативнойнашей ‚работерубцовойбыло жидкостиосуществленона бактериальныеисследование клетки, при этом проведена серия экспериментов с использованием репортерных штаммов бактерий, у которых стресс море клонированы перед генами свечения, Применение штамма E.coli SabA::lux, р р использованный промотор отвечает за синтез ие (6) дегидразы, представляющего собой ключевой фермент реакций ИОСИНТЕЗА жирных кислот мембраны, а также штамма E.coli ibpA::lux, в которой специфический промотор отвечает за синтез шаперона теплового Ro связывающего белки и облегчающего их последующий рефолдинг в зависимыми шаперонами , не позволило зарегистрировать каких либо значительных эффектов (рис.27).
faba a(UPD
600000 аЕ ен
500000 елПВАBesОates eeСЕН НЫaegisСА PekАЕ ks = ИgtPit
£00000 42И‚a PERE oeSea МЕay ageBOSS =KASMeeИЕНboasя
ReeseОНР И
2 s00000 Pecoа gene
200000 isis, УЧ: tae be aie = я
|иЕ7 RU granarygyа
рт гоиИвsat
Аетао
ЕН ae г co
14 yz че ао 22h 25) zal aims lar vad
ae a esро
нативной рубцовой жидкости
Рис27 — Динамика отклика рекомбинантного штамма E.coli К12 fabA::luxCDABE в
:
faba (ner
о рии ее
eeа hee _ a иНТSs — /
Ри. ииeeНио.eee ee See eeЯ
п. т ии i
а See err oe
р и т eet
СО о.аeSтьоеаооя.
200000 ОВ о taco
ЕОАPE OIEт а. маааа Raaгиeea 4
и
fecoee, geт ОИores ereстен ey
тЕ7 10 р13за16 19Timeо22 25 ze 3 2 se 377 40
Рис. 28 — Динамика отклика рекомбинантного штамма E.coli К12 fabA::luxCDABEв искусственной рубцовой Идо Однако штамм E.coli katG::lux, в котором клонированный промотор отвечает за синтез каталазы, обеспечивающей нейтрализацию пероксида водорода, продемонстрировал индукцию свечения, достигаемую 3,0 142
относительных единиц на 60 минуте контакта. Данныйя факт aia aesто. пероксиданаличии активныхводорода,формспособныхкислорода,диффундироватьв первую очередьв средестабильныхHa з начиantl расстоянияHесмотря и свободнона то, проникать, что предшественником через мембраны клеток.данной формы метаболболитов кислорода является супероксид анион, при су тствие его в среде зарегистрировано не было, что подтверждает отсутствие ответа штамма ииЕ.с
| м специфическийй п промоторр отвечает за синтез регуляторного soxS:белка их,в системе в котор о кислительногоi стресса. С другойit стороны это не отменяет 2 on возможности наличия в среде супероксид аниона, м Ем незначительной продолжительности жизни, он ры ee расстояния от места своего образования и акцептиру компонентами рубцбцовой жидкости. елков Изучение генотоксических эффектов, основанное на weie я lux. системы репарации RecA/LexA с использованием штамма E.coli rec. ie позволило зарегистрировать эффекты индукции свечения да бактериальных клеток п р и контакте с нативной рубцовой жидкостью. Подобныйпероксида водородрезульт а т напроисходитмолекулу ДНК,вследствиелибо лиформибо и р прямогоованияр. ивоздействияНИ идроксильного радикала, вызывающего нарушения в структуре нукля гк и слот,др причем от данного метаболита 6:бактериальная клетка не имеет защитныхподобных генотоксическихмеханизмов. С эффектовдругой выявленостороны, недлябыло,штаммаи уровеньЕсойие acolD::lex не увеличивался при контакте с рубцовой жидкостью. Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали возможность оценки токсичности рубцовой жидкости с использованием a ляется прямымсенсорныхотражениемштаммов бактерий,дезинтегрирующегоу которых уровеньхарактералюминесценциидействия средBe Pas клеточные компоненты. пПри этом показана двустадийная зависимость изменения свечения, заключающаяся в первичном его тушении с последующaa дифференциальнойвосстановлением,vaдажебиотоксичности превышающимвыявилоконтрольные.формирован! С другойие стороныактивных теформр
5 ть Ha различные компоненты
бактериальнойкислорода, способных клетки, включая— воздействова ДНК, что является вариантомто: гено’Ht токсического эффекта. ‘A По результатам исследований разработан aaa биохемилюминесцентнойnate!HT Ha изобретениер РФоценки№2603104),токсичностиоснованныйрубцовойя на биолюминесцжидкостиН fing 24реакциичасовой штаммаинкубации Е. Coliв«Эколюм-9»,условиях «искусственноговведенного в рубцовуюрубца»,6 путемжидкость,измерен> послеie в ме на интенсивности свечения бактерий в пробе в НЕПрЕВЫВНОМ рожи микропланшетном люминометре ГМ-01Т, и учета значений по формуле: 143
