цельноклеточные биосенсоры обычно трансформированы рекомбинантными плазмидами и они имеют в составе этих плазмид промотор, отвечающий на воздействие экотоксикантом транскрипцией репортерного гена, находящегося под контролем этого промотора, и дают в результате трансляции репортерный белок, который легко измерить с помощью флуориметра, люминометра или цветной реакции (Hu, Z. H. and Yu, Н. О., et al., 2006; Ни, Z. Н., et al., 2008; Huang, Н., et al., 2010; Ishino, Y., et al., 1998; Kim, М., et al., 2011; Mobashar, M., et al., 2010; Попов B.B., Рыбина E.T., 1983). Оказалось, что цельноклеточные биосенсоры быстро отвечают на наличие в среде экотоксикантов и в этом качестве превосходят физико-химические методы анализа (Findley, S.D., et al., 2011; IPCC, 2007; Lean, I.J., et al., 2011; Pukall, R., et al., 2009; Чумакова, Р.И. и др., 1975). Цельноклеточные биосенсоры могут успешно применяться для научных целей: при оценке изучения генетической экспрессии, при физиологических исследованиях на животных, растениях и человеке. Преимущества использования цельноклеточных биосенсоров связаны с их высокой специфичностью, селективностью и экспрессностью. Новые возможности использования цельноклеточных биосенсоров связаны также с возможностью изучать процессы в клетке, которые были ранее недоступны для анализа (Brulc, J.M., et al., 2009; Handelsman, J.. 2004). Принципиальной особенностью использования цельноклеточных биосенсоров является способность с их помошью оценить, не только биодоступность аналита, но и физиологическое значение получаемых данных. Генетически измененные цельноклеточные биосенсоры реагируют на наличие аналита путем индукции гена, связанного с чувствительным к аналиту промотором путем создания гибридного (фьюз) гена (Davis, C.K., et al., 2012; Griffith, G.W., et al., 2010; Janssen, P.H., Киз, М. 2008; Kingston-Smith, А.Н., et al., 2005). Обычно такие гибридные гены существуют в генетически трансформированных бактериальных клетках в составе плазмид, которыми трансформируют клетки (Frutos, P., et al., 2008; Li, К. Et al., 2012). Структурная часть генетической конструкции кодирует измеряемый аналитическим способом репортерный белок. Сливаемый со структурным геном промотор обычно представляет собой регуляторныйБиодоступныйкомпонент, селективныйи индуцируемый аналитом. взаимодействует с промотороманалит проходитгена-репортерачерезнепосредственномембрану клеткиили путеми инактивации его репрессора. Индуцированный ген транскрибируется (Blank, R., et al., 2003; Krause, D.O., et al., 2001; Lema, M.,et al., 2001; Qi, M.,et al., 2011). Трансляция мРНК репортерного гена приводит к синтезу белка, который легко регистрируется. Транскрипционные конструкции, созданные путем слияния (fuse, фьюза) гена — репортера и промотора являются мощным орудием для изучения экспрессии бактериальных генов в природной среде обитания и для детекции определенных соединений в окружающей среде (Kaiser K.L., Esterby S.R., 1991; Liggenstoffer, A.S., et al., 2010; Rattray, RM. & Craig, А.М. 2007). Хотя транскрипционные конструкции, созданные для этой цели, часто оказываются достаточно слабо экспрессируемыми, и их индукция может
происходить в течение длительного времени и экотоксикант может поступить к биосенсору в ограниченный промежуток времени, необходимость определять экспрессию генарепортера, существует. Действительно, определение экотоксиканта может быть принципиально важно для понимания экологической обстановки в данном регионе (Kingston-Smith, А. Н., et al., 2003; Mackie, R.L., et al., 2007; McQuigge, M., et al., 2000). Для того, чтобы синтез репортерного белка произошел, необходимо создать генно-инженерными методами плазмиду с клонированным в нее “теном-репортером” под управление промотора, который отвечает на исслелуемый аналит (Bayer, Е.А. & White, B.A. 2012; Devillard, E., et al., 2006; Fries, С. F., et al., 2002), Несколько условий необходимо, чтобы использовать такую биосенсорную конструкцию. Во-первых, генетическая конструкция, отвечающая за синтез репортерного белка, должна быть относительно простой, во-вторых, специфичность чувствительного элемента (промотора) по отношению к аналиту - высокой, и, наконец, в клетке должны отсутствовать сходные протеины или субстраты, которые могут помешать определению данного репортерного белка (McSweeney, C.S. & Makkar, Р.5. 2005; Quirk, MF., et al., 1988). Обычно промоторы и энхансеры располагают в с15- положении по отношению к структурному целевому гену. Исследования на клеточных культурах и трансгенных животных позволили отобрать репортерные гены и транскрипционные элементы, ответственные 3a тканево-специфическую экспрессию генов, в частности тех, которые могут участвовать в ответе на заболевания (Dehority, В.А. 2003; Duffy, G.. 2003). Было показано, что воздействие на некоторые гены необходимо для лечения наследственных, вирусных, бактериальных, восталительных, сердечно - сосудистых и раковых заболеваний. Была оценена также роль генов межклеточной коммуникации и их влияние на активность ряда генов у микроорганизмов (Bayer, S., et al., 2010; Davis, C.K., et al., 2011; Rubanza, C.D.K., et al., 2005). Научные исследования позволили изучить с15-действующие структуры генома(энхансеры, промоторы). Работы на клеточных культурах и трансгенных животных и растениях позволило отобрать репортерные гены, ответственные за базальный и тканевоспецифический уровень синтеза белков клетки. Идентификация некоторых белка),репортерныхкоторыегеновмогут(люциферазыиспользоватьсясветляковкак неинвазивныеи зеленогомаркерыфлуорсцирующегогенетической экспрессии, позволяет в режиме реального времени (например, с помощью конфокальной ‘спектороскопии) следить за экспрессией репортерных и регулирующих метаболизм клетки белков Belkin S., 2003; Benson, A.K., et al., 2010; Pariza, M.W. 2004; Scharrer, Е. and Grenacher, B., 2002; Schoefer, L., et al., 2002; Shedova, Е. N., et al., 2009; Shin, E.C., et al., 2004; Shin, Н. $., et al., 2001). Так, можно оценить влияние различных транскрипционных факторов и медиаторных механизмов клетки для лечения ряда заболеваний, включая рак, вирусные, воспалительные инфекции, сердечно-сосудистые заболевания Belanche, A. Et al., 2012; Dodd, D.,et al., 2011).
Цельноклеточные биосенсоры и репортерные гены в настоящее время широко используются для обнаружения различных по химическому составу и структуре соединений. Tak, например, имеются биосенсоры, с помощью которых можно оценить наличие в среде металлов. Можно определить целый рял органических соединений, пестицидов, мутагенов, генотоксикантов BeraMaillet, C., et al., 2009; Purushe, J., et al., 2010). В последние годы реплортерные широко используются в качестве тонкого молекулярно-биологического инструмента в фундаментальных и прикладных исследованиях в биологии, химии и медицины. В результате работ последнего десятилетия были отобраны репортерные белки, наиболее удобные для регистрации. В настоящее время в биосенсорах используются восемь уникальных репортерных белков: зеленый флуоресцирующий белок (СЕР) и его мутантные производные (например, CFP, YFP), В - галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза, бактериальная люцифераза и люцифераза светляков, акворин, уропорфироген Ш метилтрансфераза, красный флуоресцирующий белок кораллов ( DsRed) Graulet, B., et al., 2005; Lettat, А., et al., 2010). Это положило начало использованию модифицированных микроорганизмов в качестве биотестов Krause, D.O., et al., 2001; Lettat, A., et al., 2012). Биотестирование (биологическое тестирование, экотоксикологический анализ) — это оценка токсических эффектов действия химических веществ и смесей по физиологическим, морфологическим реакциям, поведенческим изменениям, изменениям выживаемости, плодовитости тест-организмов (Broudiscou,Под L. Р. and Lassalas,B., 2000, Plaizier, J.C., et al., 2008). среды с помощьюбиотестированиемтест-объектов,понимаютсигнализирующих процедуру установления токсичностиоб опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов (Ferrer, M., et al., 2007; Janssen, P.H., Киз, M., 2008; Shingfield, К. J., et al., 2009; Shu, Q,, et al., 2000; Skillman, L.C., et al., 2006; Smith, А.Н. & Mackie, R.I. 2004; St-Pierre, В. & Wright, A-D.G. 2012; Suen, G., et al., 2011; Sultana, Н., et al., 2001; Sun, P., et al., 2012). Биотестирование состоит в определении токсичности среды непосредственно при действии ее на живой организм Ferrer, М., et al., 2005; Long, L.,et al., 2008). Биотоксичность может быть тестирована на различных моделях (простейших, бактерий) и оценивается с использованием сенсорных тестpe в системеЖивыеклассификации организмы, принадлежащиевсего живого на различнымЗемле, по-разномуиерархическимреагируютуровнямна токсичные вещества, но всех их объединяет одно гениальное изобретение Природы: единица жизни в каждом организме — клетка. Известно также, что все качественные реакции при воздействии тех или иных токсикантов начинаются Р.на клеточномet al., 2011;уровнеSundset,(BergМ. МШег,М.Е.,A., et al., 2008;et al., 2009;Sylvester, Gagen,J.T., E.J.,et etal al.,., 2005; 2012;2004;Sun,
