происходить в течение длительного времени и экотоксикант может поступить к биосенсору в ограниченный промежуток времени, необходимость определять экспрессию генарепортера, существует. Действительно, определение экотоксиканта может быть принципиально важно для понимания экологической обстановки в данном регионе (Kingston-Smith, А. Н., et al., 2003; Mackie, R.L., et al., 2007; McQuigge, M., et al., 2000). Для того, чтобы синтез репортерного белка произошел, необходимо создать генно-инженерными методами плазмиду с клонированным в нее “теном-репортером” под управление промотора, который отвечает на исслелуемый аналит (Bayer, Е.А. & White, B.A. 2012; Devillard, E., et al., 2006; Fries, С. F., et al., 2002), Несколько условий необходимо, чтобы использовать такую биосенсорную конструкцию. Во-первых, генетическая конструкция, отвечающая за синтез репортерного белка, должна быть относительно простой, во-вторых, специфичность чувствительного элемента (промотора) по отношению к аналиту - высокой, и, наконец, в клетке должны отсутствовать сходные протеины или субстраты, которые могут помешать определению данного репортерного белка (McSweeney, C.S. & Makkar, Р.5. 2005; Quirk, MF., et al., 1988). Обычно промоторы и энхансеры располагают в с15- положении по отношению к структурному целевому гену. Исследования на клеточных культурах и трансгенных животных позволили отобрать репортерные гены и транскрипционные элементы, ответственные 3a тканево-специфическую экспрессию генов, в частности тех, которые могут участвовать в ответе на заболевания (Dehority, В.А. 2003; Duffy, G.. 2003). Было показано, что воздействие на некоторые гены необходимо для лечения наследственных, вирусных, бактериальных, восталительных, сердечно - сосудистых и раковых заболеваний. Была оценена также роль генов межклеточной коммуникации и их влияние на активность ряда генов у микроорганизмов (Bayer, S., et al., 2010; Davis, C.K., et al., 2011; Rubanza, C.D.K., et al., 2005). Научные исследования позволили изучить с15-действующие структуры генома(энхансеры, промоторы). Работы на клеточных культурах и трансгенных животных и растениях позволило отобрать репортерные гены, ответственные за базальный и тканевоспецифический уровень синтеза белков клетки. Идентификация некоторых белка),репортерныхкоторыегеновмогут(люциферазыиспользоватьсясветляковкак неинвазивныеи зеленогомаркерыфлуорсцирующегогенетической экспрессии, позволяет в режиме реального времени (например, с помощью конфокальной ‘спектороскопии) следить за экспрессией репортерных и регулирующих метаболизм клетки белков Belkin S., 2003; Benson, A.K., et al., 2010; Pariza, M.W. 2004; Scharrer, Е. and Grenacher, B., 2002; Schoefer, L., et al., 2002; Shedova, Е. N., et al., 2009; Shin, E.C., et al., 2004; Shin, Н. $., et al., 2001). Так, можно оценить влияние различных транскрипционных факторов и медиаторных механизмов клетки для лечения ряда заболеваний, включая рак, вирусные, воспалительные инфекции, сердечно-сосудистые заболевания Belanche, A. Et al., 2012; Dodd, D.,et al., 2011).
Цельноклеточные биосенсоры и репортерные гены в настоящее время широко используются для обнаружения различных по химическому составу и структуре соединений. Tak, например, имеются биосенсоры, с помощью которых можно оценить наличие в среде металлов. Можно определить целый рял органических соединений, пестицидов, мутагенов, генотоксикантов BeraMaillet, C., et al., 2009; Purushe, J., et al., 2010). В последние годы реплортерные широко используются в качестве тонкого молекулярно-биологического инструмента в фундаментальных и прикладных исследованиях в биологии, химии и медицины. В результате работ последнего десятилетия были отобраны репортерные белки, наиболее удобные для регистрации. В настоящее время в биосенсорах используются восемь уникальных репортерных белков: зеленый флуоресцирующий белок (СЕР) и его мутантные производные (например, CFP, YFP), В - галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза, бактериальная люцифераза и люцифераза светляков, акворин, уропорфироген Ш метилтрансфераза, красный флуоресцирующий белок кораллов ( DsRed) Graulet, B., et al., 2005; Lettat, А., et al., 2010). Это положило начало использованию модифицированных микроорганизмов в качестве биотестов Krause, D.O., et al., 2001; Lettat, A., et al., 2012). Биотестирование (биологическое тестирование, экотоксикологический анализ) — это оценка токсических эффектов действия химических веществ и смесей по физиологическим, морфологическим реакциям, поведенческим изменениям, изменениям выживаемости, плодовитости тест-организмов (Broudiscou,Под L. Р. and Lassalas,B., 2000, Plaizier, J.C., et al., 2008). среды с помощьюбиотестированиемтест-объектов,понимаютсигнализирующих процедуру установления токсичностиоб опасности независимо от того, какие вещества и в каком сочетании вызывают изменения жизненно важных функций у тест-объектов (Ferrer, M., et al., 2007; Janssen, P.H., Киз, M., 2008; Shingfield, К. J., et al., 2009; Shu, Q,, et al., 2000; Skillman, L.C., et al., 2006; Smith, А.Н. & Mackie, R.I. 2004; St-Pierre, В. & Wright, A-D.G. 2012; Suen, G., et al., 2011; Sultana, Н., et al., 2001; Sun, P., et al., 2012). Биотестирование состоит в определении токсичности среды непосредственно при действии ее на живой организм Ferrer, М., et al., 2005; Long, L.,et al., 2008). Биотоксичность может быть тестирована на различных моделях (простейших, бактерий) и оценивается с использованием сенсорных тестpe в системеЖивыеклассификации организмы, принадлежащиевсего живого на различнымЗемле, по-разномуиерархическимреагируютуровнямна токсичные вещества, но всех их объединяет одно гениальное изобретение Природы: единица жизни в каждом организме — клетка. Известно также, что все качественные реакции при воздействии тех или иных токсикантов начинаются Р.на клеточномet al., 2011;уровнеSundset,(BergМ. МШег,М.Е.,A., et al., 2008;et al., 2009;Sylvester, Gagen,J.T., E.J.,et etal al.,., 2005; 2012;2004;Sun,
Takahashi, M., et al., 2000; Thorpe, A., 2009; Tomkins, N.W. & Hunter, R.A. 2004; Tomkins, N.W., et al., 2009; Tymensen, L., et al., 2012; Van den Bogaard, А.Е. & Stobberingh, Е.Е. 2000; Vanselow, В.А. & McSweeney, С.5. 2007). Биотесты на простейших, применяемых в качестве тестов при биоиспытаниях, дают результат, имеющий высокую достоверность и сопоставимость с реакцией целого организма, HO в силу высокой сложности и трудоемкости таких методов применять эти тесты для массовой оценки пока затруднительно (Callaway, T.R., et al., 2003; Popova, M., et al., 2011). Биотестирование — это оценка реакции тест-организмов на Ty или иную субстанцию. В качестве тест-организмов, обычно, используют низшие организмы, в том числе и одноклеточные, поскольку проводить опыты с ними гораздо удобнее, чем с высшими животными (Denman, S.E. & McSweeney, С.5. 2006.; Fonty, G., et al., 2007). Среди простейших организмов на роль спасителей человека от созданной им самим беды — загрязнения среды обитания — имеются два претендента: бактерии и инфузории (FAO, 2003., Karnati, 5.К.В., et al., 2003; Magnuson, K., et al., 1993). Из простейших в качестве биотестов используются бактерии иинфузории. Чувствительность этих организмов и достоверность результатов биотестирования во многом зависят от условий их культивирования и подготовки к исследованию. Использование инфузорий для тестирования имеет свои преимущества: они имеют короткий цикл размножения, поэтому быстро достигается высокая численность популяции, они просты в содержании и достаточно чувствительны. В аналитическом аспекте инфузории интересны тем, что могут рассматриваться как простые рецепторно-эффекторные системы, обладающие способностью реагировать на химическое воздействие целым комплексом биологических, физиологических и биохимических изменений (Franzolin, R., et al., 2012; Potter, А.А., et al., 2004; Vazquez-Anon, М. and Jenkins, Т., 2007). Инфузории — это одноклеточные эукариотические организмы, TO есть у них есть ядро (а у многих видов инфузорий даже два ядра). Почти все клетки человека и других высших животных имеют ядра, а бактерии — прокариоты (безъядерные). Инфузории были одним из любимых объектов биологов еще лет сто назад, но и сейчас они остаются в центре внимания. Совсем недавно расиифровали геном инфузорий из рода Tetrahymena, состоящий из 27 тысяч генов (Galo, Е., et al., 2003; Guan, T.Y. & Holley, В.А. 2003; Wadud, S., et al., 2001; Wang, ¥. and McAllister, T. A., 2010). Эти одноклеточные - в основном свободноживущие организмы, которые в воде и почве поедают бактерии и водоросли. Они — необходимое звено в трансформации органики, их вклад в биологический круговорот веществ не менее важен, чем у бактерий. Живут инфузории практически везде: в пресных и соленых водах, почве, и число их видов, по разным источникам от 7 до 10 тысяч (Garcia, C.C.G., et al, 2000; Lema, M, et al., 2001; Makkar, Н.Р.5. & Viljoen, G.J., 2005).
