Биотесты с использованием живых бактерий отличаются от современных биотестов, использующих инфузории, дафнии, водоросли, рыб, лишь тем, что в качестве параметра жизнедеятельности измеряется биолюминесценция.
Биотесты на светящихся бактериях дают количественную меру токсичности и часто превосходят известные биотесты по быстродействию, точности, чувствительности и простоте, позволяют контролировать одновременно значительное число токсикантов (Dschaak, С. М., et al, 2011; Gill, Н.5., et al, 2000). В таблице 1 представлены все известные к настоящему времени биотесты на светящихся бактериях.
| Таблица 1 — Бактериальные | биолюминесцентные биотесты |
|---|---|
| Биотест | Действующие вещества. |
| Загрязнение пищевых продуктов микотоксинами (7,53-31,79 мкг/мл | |Рубратоксин В, зеараленон, пенициллин, | патулин, цитринин, охратоксин A, РР- |TOKCHH, афлатоксин В1 |
| Присутствие B среде антибиотиков (0,2 мкг/мл) | |Тетрациклин, хлорамфеникол, стрептомицин, неомицин, гентамицин, канамицин |
| Токсичность сточных вод и| водной среды | Ароматические углеводороды, дыхательные яды, фенольные соединения и продукты их деструкции, сульфатный лигнин, окрашенные фракции стоков, фенолоксидазы, детергенты, пестициды, тяжелые металлы, кобальт, отходы производства стабилизаторов |
| Токсичность в воздушной среде (компоненты ракетного топлива) | |Диметилгидразин, альдегиды, спирты, |ацетон, НСМ, SQ, , H2S, Ch, продукты облучения смеси NO и цис-2-бутена |
| `Монурон, диурон, нефурон, атразин | |
| Определение бактерицидной активности в сыворотке человека. | |Иммуноглобулины, комплементы |
| Модельное изучение влияния | |Температура, давление, лекарственные |
| POT aa in физических | | препараты, аи (галотан), |
| факторов | глицерин, сахароза |
| сланцев | |
| : | |
| not“aae Ral a | aie lee a трата: |
| pe SEA aa AIL S08 a JTL nt лы SOT р | TGC рии, анализируемых р анеществ, |
| установление связи между характеристиками токсичности среды. | параметрами свечения и количественными |
Каждый из этапов имеет свои особенности, связанные с тем, какая культура бактерий используется для анализа. Поэтому все известные к настоящему времени биотесты удобно классифицировать по способу приготовления тестовой культуры (периодической или непериодической) или реагентов на основе бактерий (Kingston-Smith, А.Н., et al, 2005; Ohene-Adjei, S., et al, 2008; Yu, P., et al, 2003; Zang, С. L., et al, 2010; Zhao, Т., et al 2000; Zhou, М., etal, 2011). Чувствительность светящихся бактерийк различным вешествам зависит от многих факторов, и, прежде всего, от штамма и условий культивирования бактерий (состава питательной среды, рН среды, фазы роста бактерий и т.д.) (Guenoune, D., et al, 2002; McSweeney, C.S., et al, 2006; Zhou, M., et al, 2009). Было показано, что наиболыпая чувствительность к аминазину (0,25 MM) достигается при использовании для анализа Р. phosphoreum в конце экспоненциальной фазы роста и Р. fisheri в начале экспоненциальной и в стационарной фазах роста на полусинтетической средес пептоном, глицерином и концентрациейОписанные МаСТ— 50 г/л, pH 8,0. в литературе методы тестирования ксенобиотиков отличаются лишь небольшими модификациями. Например, в значительных пределах может меняться количество клеток, взятых для анализа, или объем анализируемой пробы. Однако в силу относительности измерений такие модификации не влияют существенно на последовательность проводимых операций (Calsamiglia S., et al, 2007; Edwards, J.E., et al, 2008; Zoetendal, E.G., et al, 2003) Все тесты с использовапием периодической культуры сходны между собой — сравнивается свечение бактерий в контроле и в присутствии анализируемых веществ или их смесей. При создании тест-системы Ha основе светящихся бактерий часто возникает задача повышения чувствительности бактериальных клеток к низким концентрациям тестируемых соединений (Lodge-Ivey, S.L., et al, 2005; Molan, ALL., et al, 2001; Moss, А.В. et al, 2000; Zoetendal, E.G., et al, 2008). Этого можно достичь изменением условий культивирования, способа обработки токсикантом, использования специфических чувствительных мутантных штаммов. Все эти подходы были использованы при создании тест-системы на различные фенолы и их производные, сульфопроизводные янтарной кислоты и гексахлоранциклогексана (ГХЦГ) (Chaucheyras-Durand, Е. et al, 2010; Ни, Z. Н. and Yu, Н. Q, 2006; Ley, В.Е., et al, 2008; Георгиевский, В. И.. 1990). Для выяснения механизма их действия на люминесцентную систему необходимо иметь представление и о влиянии этих веществ на жизнеспособность клеток и сохранность их структур. В ряде экспериментов изучали действие на ультраструктуру и выживаемоеть Р. Ieiognathi и У. harveyi после обработки клеток гидрохиноном, п-бензохиноном, резорцином, пирокатехином.хлоридами кадмия и ртути, взятыми в концентрациях, которые вызывают 50 % тушение люминесценции. Более специфическое действие на люминесцентную систему оказывают п-бензохинон и гидрохинон, не вызывая грубых структурных
повреждений (Castillejos, L., et al, 2007, Gosalbes,M.J. et al, 2011). Резорцин и хлорид кадмия являются структурно-неспецифическими агентами, поэтому обработка этими соединениями вызывает структурные повреждения, затрагивающие все компартменты клетки и многие важные функции, в том числе и люминесценцию, что оуказыает на возможность создания избирательных тестов (Kelly, W.J. et al, 2010$ Moallem, U. Et al, 2010). Несмотря на очевидные преимущества биолюминесцентного тестирования, такие тесты до сих пор не паспортизованы и не доказана правомерность их использования в качестве индикатора загрязнения окружающей среды (Marx, Н. Et al, 2011). Для этого прежде всего необходимо провести сопоставление результатов биолюминесцентного тестирования и других современных биотестов (Padmanabha J., et al, 2004).
Считается, что среди большого разнообразия мутантов можно выбрать штаммы, избирательно чувствительные к определенным веществам. Однако успешных работ в этом направлении пока мало. Зато появились работы, сделанные с использованием рекомбинантных светящихся бактерий, где успешно эксплуатируется идея о том, что излучающие ферменты- люциферазы и их гены в последние годы стали самыми привлекательными и употребительными маркерами в генетике, эмбриологии, молекулярной биологии, в мониторинге окружающей среды и для биохимической диагностики в медицине (McSweeney, C.S., et al, 2005; , Mensink, В.Р. et al, 2003). Поэтому помимо использования в люминесцентном анализе природных светящихся бактерий ведется разработка новых направлений биотестирования, и одним из них является использование в качестве тест-объекта люминесцентных рекомбинантных штаммов различных бактерий (Е. coli, Pseudomonas, Rysobium и другие) (Dodd, D., et al, 2000; Ingelbrecht, J. A., et al, 2000). К настоящему времени описано клонирование ‘и экспрессия генов люминесцентной системы светящихся бактерий Vibrio harveyi, У. fischeri HP. leiognati в плазмидном векторе клеток различных микроорганизмов (Min В.В. et al, 2002, Mitsumori М., et al, 2011). Введение шх-гена позволяет создавать высокочувствительные биосенсоры, обладающие высокой спепифичностью. Например, сконструированы бактерии, в которых под действием токсикантов увеличивается свечение. С помощью такого биолюминесцентного биосенсора, созданного на основе Е. coli, можно установить наличие в среде (и в смесях тяжелых металлов) ртути. Принцип действия этого биосенсора заключается в увеличении экспрессии шх-генов при наличии в среде ионов ртути. Чувствительность метода выше, чем в атомной абсорбционной спектроскопии. Подобный биосенсор на основе бактерий Pseudomonas putida сконструирован и для определения в.среде нафталина, толуола, ксилола (Camboim, E.K.A., et al., 2012; Denman, S.E., et al., 2012). Бактерии рода Rysobium использованы для конструирования люминесцентного биосенсора загрязнения почвы. Некоторые штаммы бактерий рода Salmonella использованы для конструирования люминесцентного биотеста, позволяющего определять распределение бактерий на поверхности различных пищевых продуктов. Было предложено встраивать 25
