Каждый из этапов имеет свои особенности, связанные с тем, какая культура бактерий используется для анализа. Поэтому все известные к настоящему времени биотесты удобно классифицировать по способу приготовления тестовой культуры (периодической или непериодической) или реагентов на основе бактерий (Kingston-Smith, А.Н., et al, 2005; Ohene-Adjei, S., et al, 2008; Yu, P., et al, 2003; Zang, С. L., et al, 2010; Zhao, Т., et al 2000; Zhou, М., etal, 2011). Чувствительность светящихся бактерийк различным вешествам зависит от многих факторов, и, прежде всего, от штамма и условий культивирования бактерий (состава питательной среды, рН среды, фазы роста бактерий и т.д.) (Guenoune, D., et al, 2002; McSweeney, C.S., et al, 2006; Zhou, M., et al, 2009). Было показано, что наиболыпая чувствительность к аминазину (0,25 MM) достигается при использовании для анализа Р. phosphoreum в конце экспоненциальной фазы роста и Р. fisheri в начале экспоненциальной и в стационарной фазах роста на полусинтетической средес пептоном, глицерином и концентрациейОписанные МаСТ— 50 г/л, pH 8,0. в литературе методы тестирования ксенобиотиков отличаются лишь небольшими модификациями. Например, в значительных пределах может меняться количество клеток, взятых для анализа, или объем анализируемой пробы. Однако в силу относительности измерений такие модификации не влияют существенно на последовательность проводимых операций (Calsamiglia S., et al, 2007; Edwards, J.E., et al, 2008; Zoetendal, E.G., et al, 2003) Все тесты с использовапием периодической культуры сходны между собой — сравнивается свечение бактерий в контроле и в присутствии анализируемых веществ или их смесей. При создании тест-системы Ha основе светящихся бактерий часто возникает задача повышения чувствительности бактериальных клеток к низким концентрациям тестируемых соединений (Lodge-Ivey, S.L., et al, 2005; Molan, ALL., et al, 2001; Moss, А.В. et al, 2000; Zoetendal, E.G., et al, 2008). Этого можно достичь изменением условий культивирования, способа обработки токсикантом, использования специфических чувствительных мутантных штаммов. Все эти подходы были использованы при создании тест-системы на различные фенолы и их производные, сульфопроизводные янтарной кислоты и гексахлоранциклогексана (ГХЦГ) (Chaucheyras-Durand, Е. et al, 2010; Ни, Z. Н. and Yu, Н. Q, 2006; Ley, В.Е., et al, 2008; Георгиевский, В. И.. 1990). Для выяснения механизма их действия на люминесцентную систему необходимо иметь представление и о влиянии этих веществ на жизнеспособность клеток и сохранность их структур. В ряде экспериментов изучали действие на ультраструктуру и выживаемоеть Р. Ieiognathi и У. harveyi после обработки клеток гидрохиноном, п-бензохиноном, резорцином, пирокатехином.хлоридами кадмия и ртути, взятыми в концентрациях, которые вызывают 50 % тушение люминесценции. Более специфическое действие на люминесцентную систему оказывают п-бензохинон и гидрохинон, не вызывая грубых структурных
повреждений (Castillejos, L., et al, 2007, Gosalbes,M.J. et al, 2011). Резорцин и хлорид кадмия являются структурно-неспецифическими агентами, поэтому обработка этими соединениями вызывает структурные повреждения, затрагивающие все компартменты клетки и многие важные функции, в том числе и люминесценцию, что оуказыает на возможность создания избирательных тестов (Kelly, W.J. et al, 2010$ Moallem, U. Et al, 2010). Несмотря на очевидные преимущества биолюминесцентного тестирования, такие тесты до сих пор не паспортизованы и не доказана правомерность их использования в качестве индикатора загрязнения окружающей среды (Marx, Н. Et al, 2011). Для этого прежде всего необходимо провести сопоставление результатов биолюминесцентного тестирования и других современных биотестов (Padmanabha J., et al, 2004).
Считается, что среди большого разнообразия мутантов можно выбрать штаммы, избирательно чувствительные к определенным веществам. Однако успешных работ в этом направлении пока мало. Зато появились работы, сделанные с использованием рекомбинантных светящихся бактерий, где успешно эксплуатируется идея о том, что излучающие ферменты- люциферазы и их гены в последние годы стали самыми привлекательными и употребительными маркерами в генетике, эмбриологии, молекулярной биологии, в мониторинге окружающей среды и для биохимической диагностики в медицине (McSweeney, C.S., et al, 2005; , Mensink, В.Р. et al, 2003). Поэтому помимо использования в люминесцентном анализе природных светящихся бактерий ведется разработка новых направлений биотестирования, и одним из них является использование в качестве тест-объекта люминесцентных рекомбинантных штаммов различных бактерий (Е. coli, Pseudomonas, Rysobium и другие) (Dodd, D., et al, 2000; Ingelbrecht, J. A., et al, 2000). К настоящему времени описано клонирование ‘и экспрессия генов люминесцентной системы светящихся бактерий Vibrio harveyi, У. fischeri HP. leiognati в плазмидном векторе клеток различных микроорганизмов (Min В.В. et al, 2002, Mitsumori М., et al, 2011). Введение шх-гена позволяет создавать высокочувствительные биосенсоры, обладающие высокой спепифичностью. Например, сконструированы бактерии, в которых под действием токсикантов увеличивается свечение. С помощью такого биолюминесцентного биосенсора, созданного на основе Е. coli, можно установить наличие в среде (и в смесях тяжелых металлов) ртути. Принцип действия этого биосенсора заключается в увеличении экспрессии шх-генов при наличии в среде ионов ртути. Чувствительность метода выше, чем в атомной абсорбционной спектроскопии. Подобный биосенсор на основе бактерий Pseudomonas putida сконструирован и для определения в.среде нафталина, толуола, ксилола (Camboim, E.K.A., et al., 2012; Denman, S.E., et al., 2012). Бактерии рода Rysobium использованы для конструирования люминесцентного биосенсора загрязнения почвы. Некоторые штаммы бактерий рода Salmonella использованы для конструирования люминесцентного биотеста, позволяющего определять распределение бактерий на поверхности различных пищевых продуктов. Было предложено встраивать 25
шх-гены в бактериофаги, которые, внедряясь в клетку-хозяина, через от 30 до 50 мин вызывают экспрессию lux-reHoB. С использованием этого приема был разработан метод определения бактериальных клеток непосредственно в молоке, который позволяет «уловить» до 10 клеток в образце (Morgavi, D.P., et al, 2012; Or-Rashid, М. М., et al, 2003). Таким образом, приведенные выше данные иллюстрируют актуальность и фундаментальную ценность новых знаний о механизмах взаимодействия микроорганизмов, населяющих рубец жвачных, определяющих бактерицидную активность кормового фактораи компонентов рубцовой жидкости.
- Исследования по оценке влияния типа кормления и породы на рубцовое пищеварение молодняка крупного рогатого скота В настоящее время нет общепризнанной теории, объясняющей внутривидовые различия в проявлении продуктивного потенциала животных. В связи с этим сравнительное изучение пищеварения и обмена веществ молодняка крупного рогатого скота разного генетического потенциала является актуальным. Исследования проводились методом периодов (50 дней), на двух группах животныхстепной породы).12 мес. возраста (I группа - бычки герефордской, П — красной Таблица2 - Структура рационов подопытных животных,% [Сено судак | [288 | ГЗерносенаж яяменный [36,13 [= f- Гбилос кукурузный [м 14,04
Содержали животных на рационах, состоявших из следующих компонентов: сено люцерновое, сено суданки, ячменный зерносенаж, силос кукурузный, ячмень дробленый, свекла кормовая, весовая доля которых при сенажном типе кормления (первый период) составляла 21,5; 0; 36,1; 0; 28,4; 14,0%; при концентратно-силосном (второй период) 23,6; 0; 0; 24,7; 36,9; 14,8%; при сенно-концентратном (третий период) 23,2; 23,2; 0; 40,9; 12,7%, соответственно. В ходе эксперимента фактическая поедаемость кормов по группам не различалась. Переваримость и использование питательных веществ корма. В ходе эксперимента была выявлена тенденция к лучшей переваримости сухого вещества (СВ) сенажного и сенно-концентратного рационов у герефордов на 1,4-0,7%, органического (ОВ) — на 1,6-1,7%, BOB - на 2,3-1,7%. При скармливании подопытным животным концентратно-силосного рациона
