Иммуногенетика в селекции овец

Состав консерванта:

После добавления крови содержимое пробирок тщательно перемешивают. Кровь, не позднее двух суток со времени забора, доставляют в лабораторию либо в специальных холодильниках (автохолодильники), либо в термосах со смесью льда и поваренной соли в пропорции 3:1, для поддержания температуры непосредственно вблизи образцов крови не ниже +4 С, образцы отделяют от смеси прокладками из паралона толщинойв 3-4 см.

Каждая проба крови должна иметь этикетку с указанием номера животного, все необходимые сведения о котором заносят перед взятием проб крови в ведомость.

В лаборатории из полученной крови готовят 2,5 % суспензию эритроцитов и определяют антигенный состав использованием гемолитического теста (реакция гемолиза и агглютинации).

Суспензию эритроцитов получают путем центрифугирования крови в течение 10 мин при 3000 об/мин. Отделившуюся плазму отсасывают пипеткой, с помощью вакуумного насоса. К осадку доливают изотонический раствор (0,9 % раствор хлористого натрия), встряхивают, снова центрифугируют, эту процедуру повторяют трижды.

В пробирку, содержащую 9,75 мл изотонического раствора, вносят 0,25 мл трижды отмытых эритроцитов, тщательно

перемешивают. 2,5 % суспензию эритроцитов можно хранить в течение 4-5 дней при температуре +4°C.

Реакция гемолиза проводится по A.Neimann-Sorensen (1957) в модификации F.Zur (1977): в лунки пластмассовых блоков из специального оргстекла вносят 2 капли соответствующей сыворотки, одну каплю 2,5 % суспензии эритроцитов и одну каплю комплемента. Смесь встряхивают и помещают в термостат при температуре +30+2°C. Читка реакции проводится трижды: через 30 мин, 2 и 4 часа с момента внесения комплемента. Степень гемолиза определяют по бальной системе:

• 4 балла — все эритроциты гемолизированы, жидкость рав-

• номерно окрашена, прозрачна;

• 3 балла — на дне видны единичные эритроциты, образует-

• ся легкое помутнение при взбалтывании;

• 2 балла —1/2 часть эритроцитов на дне лунки, жидкость

• над осадком умеренно окрашена;

1 балл — около 3/4 частей эритроцитов на дне лунки, жидкость над осадком слабо красного цвета;

• • все эритроциты на дне лунки, над осадком жидкость слегка красная, следы гемолиза заметны в виде ободка над осевшими эритроцитами;

О — все эритроциты целые, надосадочная жидкость прозрачная.

Комплемент является основной частью в реакции гемолиза. В качестве комплемента используется натуральная кроличья сыворотка с добавлением лиофилизированной сыворотки морской свинки в соотношении 25:4. Комплемент получают из крови кроликов при забое. Кровь инкубируют при температуре +30° С в термостате в течение двух часов. От образовавшегося сгустка сыворотку отделяют центрифугированием.

В сыворотке кролика нередко встречаются натуральные антитела против эритроцитарных антигенов овец, поэтому на их наличие необходимо исследовать каждую партию комплемента гемолитическим тестом. При выявлении натуральных антител сыворотку кролика абсорбируют в соотношении 4:1 смесью эритроцитов овец дважды по 10 мин. Хранится комплемент при минус 18°C продолжительное время.

При отсутствии кроличьего комплемента можно использовать сыворотку морской свинки. Для этого кровь берут непосредственно из сердца от нескольких животных в один флакон. Сыворотка в нативном виде хранится в холодильнике при температуре -18-20° C. Перед постановкой реакции сыворотку разводят изотоническим раствором в отношении 1:20. Срок хранения такой же, как кроличьего комплемента. Сухой комплемент морской свинки непригоден для определения эритроцитарных антигенов у овец.

Реакция агглютинации. Две капли соответствующей сыворотки и одну — 2,5 % суспензии эритроцитов вносят в лунки блоков, и после встряхивания, смесь помещают в термостат при t +30+2° С. Учет результатов реакции проводят 2 раза — через 30 мин. и 2 часа с момента постановки реакции. Степень агглютинации определяется следующим образом:

• • наличие реакции, в лунке образуется хорошо видимые конгломераты склеенных эритроцитов; + - наличие небольшого количества малых конгломератов склеенных эритроцитов на две лунки;
• • отсутствие реакции.

После завершения цикла иммунизаций, у реципиентов берут большой объем (до 1 литра) крови в емкости из пластмассы. Полученную (без консерванта ) кровь выдерживают в течении 1-2 часов при комнатной температуре, разрезают об-