разовавшийся сгусток профламбированным металлическим стержнем и оставляют при комнатной температуре на сутки. За это время сыворотка отделяется от кровяного сгустка. Ее сливают, центрифугируют в течение 10 минуг при 3000 об/мин., инактивируют в водяной бане при температуре +56°C в течение 30 минуг (для разрушения комплемента). После инактивации сыворотку разливают в стеклянные или полиэтиленовые сосуды и ставят на хранение при температуре -18-20° C. Сыворотку для анализа наливают в несколько сосудов малой емкости (10-20 мл). На этикетке каждого сосуда пишут номера реципиента и донора (лабораторные и ушные), дату последней иммунизации или реиммунизации, а также номер абсорбента. Если сыворотка содержит одно антитело, то его обозначение пишут сверху этикетки.
Данные о количестве полученной поливалентной сыворотки записывают в карточку хранения «сырой» сыворотки и ведут учет по мере ее расходования.
Состав антител «сырых» сывороток выявляется методом разведения. Используя при этом стандартные разведения 1:2 — 1:4. Для исключения неспецифических реакций при их постановке необходимы свежеполученные эритроциты. Ставят два контроля: один — на качество эритроцитов, другой — на качество комплемента. Контроль эритроцитов: три капли изотонического раствора плюс одна капля 2,5% суспензии эритроцитов. Контроль комплемента: две капли изотонического раствора плюс одна капля 2,5 % суспензии эритроцитов, плюс одна капля комплемента. Контроль обязателен также и для реакции агглютинации, где вместо двух капель сыворотки берется две капли изотонического раствора. Контроль ставится против эритроцитов каждой исследуемой овцы.
При расчете необходимого количества крови для реакций исходят из того, что | мл равен 20 каплям (то есть одна капля соответствует объему 0,02 мл). Иммунологические блоки должны быть совершенно чистыми и сухими. Их предварительно тщательно моют и высушивают при температуре не выше +60° С. Результаты реакции регистрируют в специальных ведомостях, причем оценку при первом чтении реакции обозначают синей, при втором — зеленой, при третьем — красной пастой.
При проведении реакций гемолиза и агглютинации, зачастую, не только устанавливают наличие или отсутствие гемолиза или агглютинации, но и определяют титр антител, то есть наибольшую степень разбавления сыворотки изотоническим раствором, при которой происходит гемолиз. В каждую лунку, кроме первой, вносят по две капли изотонического раствора, а в первую и вторую лунки - по две капли специфической сыворотки. Затем из второй лунки отбирают две капли смеси (предварительно встряхнув блок) и переносят в третью и т. д. Таким образом устанавливают окончательный и рабочий титр исследуемой «сырой» сыворотки.
Основным и наиболее точным методом определения состава «сырых» сывороток, а также чистоты реагентов является анализ путем абсорбции. Если полученная сыворотка реагирует с конкретными эритроцитами панели, то следует провести последовательную абсорбцию этими эритроцитами. После каждой абсорбции при конфронтации сыворотки с прежней панелью могут быть две ситуации. Первая — сыворотка после абсорбции не реагирует с теми сыворотками, с которыми она реагировала до абсорбции. Это означает, что сыворотка является моноспецифическим реагентом. Вторая — после абсорбции сыворотка не реагирует только с эритроциTaMH, которыми она абсорбирована, а с остальными - реаги-
рует. Это означает, что сыворотка имеет сложный поливалентный состав и необходимо продолжить ее абсорбцию со всеми реагирующими с ней эритроцитами. Титр и характер антител в «сырой» сыворотке определяет количество необходимых абсорбций- 3-4, иногда и больше. В зависимости от числа предполагаемых абсорбций данной сыворотки берут соответственно 4 или 3 центрифужные пробирки. Их маркируют, заполняют осторожно размешенной консервированной кровью. Затем кровь отделяют от консерванта центрифугированием и 3 раза отмывают изотоническим раствором. К отмытым эритроцитам в первую пробирку наливают сыворотку, которую намечено абсорбировать данными эритроцитами. Отношение количества сыворотки к эритроцитам 1:1 или 2:3.
При анализирующей абсорбции 2-3 мл сыворотки предварительно разбавляют в отношении 1:1-8, в зависимости от титра. Абсорбцию после тщательного перемешивания смеси сыворотки с эритроцитами проводят при комнатной температуре в течение 45 мин в зависимости от сложности сыворотки. Во время инкубации содержимое пробирки 2-3 раза перемешивают, центрифугируют (5-10 мин) при 3-5 тыс. об/мин, сыворотку отделяют и переносят для следующей абсорбции во вторую пробирку с заранее приготовленными эритроцитами. Вторую абсорбцию проводят также в течение 45 мин при комнатной температуре, центрифугируют, переносят сыворотку в третью пробирку с подготовленными эритроцитами для третьей абсорбции. После последней абсорбции при комнатной температуре проводят заключительную — при +4° С, помещая пробирку со смесью эритроцитов и сыворотки на 30 мин в холодильник. Абсорбция при низких температурах удаляет холодовые и некоторые тепловые антитела.
