4.6. Иммунологические методы исследования молока (секрета)
Иммунологические факторы молока определяют локальную резистентность молочной железы, её сопротивляемость к развитию воспалительных процессов, коррелируют с факторами защиты всего организма и имеют особенности в зависимости от функционального состояния органа.
Определение лизоцимов молока по В.И. Мутовину В основу выявления лизоцимов положен метод диффузии в агар и образование зоны задержки роста тест-культуры микроба.
На агаровую пластинку в чашке Петри наносят по 0,2 мл суточной бульонной тест-культуры и равномерно распределяют по всей поверхности. Выдерживают 20-30 мин при комнатной температуре для пропитывания агара, а затем с помощью пробойника диаметром 0,8-1 см делают 4 луночки, в которые вносят по 0,01 мл (2 капли) исследуемого молока. Чашки выдерживают при комнатной температуре (18-20°С) 30-40 мин, а затем - в термостате при температуре 36-38°С 16-18 ч, после чего измеряют зоны задержки роста.
� Лизоцим молока - ЛМ
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамма ВМ 57, выделенный из молока здоровой коровы. Максимальный уровень ЛМ (25 мм и более) у здоровых коров на 2-6 месяцах лактации, у больных - понижен (менее 18 мм) или отсутствует (0 мм). Термостабилен, разрушается при температуре 70°С, в сыром молоке при температуре 4-6°С сохраняется до 10 дней.
� Лизоцим вымени - ЛВ
В качестве тест-культуры используют слёзный микрококк Флеминга. Его концентрация не коррелирует с ЛМ. Уровень в молоке повышается в конце лактации и у больных маститом коров. В сыром молоке при температуре 4-6°С сохраняется до 10 дней.
- Лизоцим колостральный - ЛК
В качестве тест-культуры используют белый стрептококк штамма 22. Максимальные концентрации ЛК обнаруживаются в молозиве, через 10 дней после отёла регистрируется ниже уровня ЛМ.
� Лизоцим термостабильный - ЛТ
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамма ВМ-57. Выявляется в молоке стародойных коров после прогревания при температуре 70°С в течение 30 мин и сохраняется до 1,5-2,0 мес., в сыром молоке сохраняется 5-7 дней.
� Лизоцим инверсионный - ЛИ
В качестве тест-культуры используют розовый стафилококк штамма 56. Отсутствует в молоке здоровых коров, обнаруживается в секрете поражённых маститом долей вымени.
� Лизоцим основной - ЛО
В качестве тест-культуры используют ацидофильную палочку штамма 17т. Определяют методом серийных разведений. В разведения молока (молозива) вносят 10% суточную бульонную тест-культуру, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение суток, затем учитывают рост. В молозиве ЛО проявляет бактерицидное действие в разведении 1:10000, на 10-й день после отёла в молоке его антибактериальная активность проявляется в разведении 1:2-1:4, а у больных маститом коров несколько повышается.
Определение истинного лизоцима (мурамидазы) Метод К. Шахани
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. 5 мл молока разводят равным объёмом 0,5% раствора натрия хлорида и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Снимают слой жира, молоко подогревают до 37°С и доводят рН до 4,6 1н раствором соляной кислоты. Выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
2) Построение калибровочных кривых. Для построения калибровочных кривых используют кипячёное молоко, в котором таким способом подавляется лизоцимная активность, а
затем из него готовят молочную сыворотку.
В качестве тест-культуры используют убитых ультрафиолетовыми лучами и лиофилизированных клеток Mycrococcus lysodeicticus, из которых готовят суспензию на 1/15М фосфатном буфере с рН 6,2, при этом экстинкция должна составлять 10-90% против дистиллированной воды (100%).
В два ряда пробирок с сывороткой молока по 3 мл вносят разные количества лизоцима (в первый ряд от 0 до 20 мкг/100 мл, во второй - от 20 до 200 мкг/100 мл), затем добавляют по 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и на спектрофотометре определяют экстинкцию (Д0) при длине волны 540 нм. После этого смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинкцию (Д20). По разности экстинкций (Д0 и Д20) смеси отдельных пробирок и соответствия ей концентрации лизоцима строят две калибровочные кривые.
Проведение анализа
К 3 мл сыворотки исследуемого молока добавляют 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и сразу же определяют на спектрофотометре экстинкцию (Д0) при длине волны 540 нм. Затем смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинкцию (Д20).
Обработка результатов
По разности экстинкций Д0 и Д20 по калибровочной кривой определяют концентрацию лизоцима.
Метод Парри в модификации Хавигера
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. 5 мл молока центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, снимают слой жира, подогревают до 37°С и осаждают казеин, доводя рН до 4,6 путём внесения 1н раствора соляной кислоты. Казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1.
2) Приготовление суспензии тест-культуры. Используют ацетоновый порошок убитой культуры Mycrococcus
