lysodeicticus, который вносят в 1/5М фосфатный буфер с рН 6,2 до конечной оптической плотности 0,65-0,70, которая не изменяется при комнатной температуре в течение 30 мин.
Проведение анализа
К 1 мл суспензии тест-культуры добавляют 1 мл разведённой физиологическим раствором сыворотки молока, быстро перемешивают и измеряют оптическую плотность Д0 на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Затем пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова определяют оптическую плотность (Д30).
Обработка результатов
Активность лизоцима выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:
УЕА = (Д0 – Д30) / 30 , где
Д0 - начальная оптическая плотность образца; Д30 - оптическая плотность через 30 мин;
30 - время инкубации образца в термостате, мин.
1 УЕА - изменение оптической плотности на 1 единицу за 1 мин 1 мл сыворотки молока.
Метод П.А. Емельяненко и др.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агаровых пластинок. 1% раствор агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере расплавляют 15-20 мин на кипящей водяной бане. В охлаждённый до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-микроба Mycrococcus lysodeicticus из расчета 20 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в прямоугольные кюветы из органического стекла размером 30х17х1,5 см так, чтобы получился слой агара толщиной 4 см. После застывания в агаре с помощью тонкостенной металлической трубочки с наружным диаметром 5 мм делают луночки на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока. Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 12-14 ч и снимают верхний слой с жиром.
3) Приготовление растворов лизоцима. Стандартный ли-
зоцим разводят в 1/15М фосфатном буфере до концентраций 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.
Проведение анализа
Растворы стандартного лизоцима и пробы молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,05 мл. Кюветы с образцами выдерживают 48 ч во влажной камере при комнатной температуре 22-24°С, а затем линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов
По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую в полулогарифмическом масштабе и с её помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.
Метод Оссермана в модификации Фараджи
Подготовка к анализу
1) Приготовление агаровых пластинок. 1% раствор агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере с рН 6,2 расплавляют 15-20 мин на водяной бане. В охлажденный до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-культуры Mycrococcus lysodeicticus из расчета 50 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в чашки Петри так, чтобы получился слой агара толщиной 4 мм. После застывания агара в нём делают луночки диаметром 1 см на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока. Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 24 ч, снимают верхний слой с жиром и разводят 1/15М фосфатным буфером в соотношении 1:10.
3) Приготовление растворов лизоцима. Стандартный лизоцим разводят в 1/15М фосфатном буфере до концентрации 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.
Проведение анализа
Растворы стандартного лизоцима и пробы разведенного молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,1 мл, выдерживают в термостате при 37°С в течение 36 ч и линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов
По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую и с её помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.
Определение общих иммуноглобулинов Методом с сульфатом натрия
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока (молозива) центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира, который легко отделяют проволочной петлей или шпателем. Обезжиренное молозиво разводят дистиллированной водой в 5-10 раз, подогревают до температуры 37°С и добавляют по каплям 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Полученную сыворотку молока (молозива) фильтруют через бумажный фильтр и используют для анализа.
2) Приготовление 18% раствора сульфата натрия. 18 г обезвоженного сульфата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в посуде с притёртой крышкой.
Проведение анализа
В пробирку вносят 1,9 мл 18% раствора сульфата натрия, добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки молока (молозива), тщательно перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 400±5 нм в кювете с рабочей гранью 5 мм относительно чистого раствора сульфата цинка. В случае получения оптической плотности выше отметок 1,300-1,500 сыворотку разбавляют физиологическим раствором в 2-3 раза. Степень разведения учитывают при расчёте конечных результатов.
Обработка результатов
По данным оптической плотности образцов сыворотки молока (молозива) с учётом степени разведения определяют концентрацию иммунных глобулинов по калибровочной таблице 8.
