Таблица 8 – Калибровочная таблица содержания иммунных глобулинов в молоке (молозиве)
| Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л | Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л | Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л |
|---|---|---|---|---|---|
| 0,01 | 12,0 | 0,15 | 191,0 | 0,65 | 730,0 |
| 0,02 | 28,0 | 0,16 | 203,0 | 0,70 | 790,0 |
| 0,03 | 35,0 | 0,17 | 214,0 | 0,75 | 840,0 |
| 0,04 | 46,0 | 0,18 | 225,0 | 0,80 | 890,0 |
| 0,05 | 57,0 | 0,19 | 236,0 | 0,85 | 950,0 |
| 0,06 | 69,0 | 0,20 | 247,0 | 0,90 | 1010,0 |
| 0,07 | 80,0 | 0,25 | 290,0 | 0,95 | 1060,0 |
| 0,08 | 91,0 | 0,30 | 340,0 | 1,05 | 1170,0 |
| 0,09 | 103,0 | 0,35 | 400,0 | 1,10 | 1230,0 |
| 0,10 | 114,0 | 0,40 | 450,0 | 1,15 | 1290,0 |
| 0,11 | 130,0 | 0,45 | 500,0 | 1,20 | 1340,0 |
| 0,12 | 146,0 | 0,50 | 570,0 | 1,25 | 1400,0 |
| 0,13 | 157,0 | 0,55 | 620,0 | 1,30 | 1450,0 |
| 0,14 | 179,0 | 0,60 | 680,0 |
Количественное определение иммуноглобулинов Метод радиальной иммунодиффузии
В основу положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой молочной сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к IgА, IgG, IgМ. 3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 смешивают нагретым до температуры 56°С в соотношении 1:1 с моноспецифической антисывороткой, в которой концентрация антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведения антисыворотки делают на 0,1М веронал-мединаловом буфере с
рН 8,6. Агар, смешанный с моноспецифической антисывороткой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластинах размером 9х12 см. Для этого на пластинку помещают латунную или пластмассовую П-образную рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинами заливают смесью агара и антисыворотки в количестве 9 мл.
2) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центрифугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
Проведение анализа
В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят по 2 мкл стандартной неразведённой и разведённой 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моноспецифической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сывороткой объёмом по 2 мкл. Пластины инкубируют во влажной камере при температуре 4°С в течение 24 ч, а пластины с антисывороткой к IgМ – 48 ч.
Обработка результатов
После окончания инкубации измеряют диаметр колец преципитации. По данным разведений стандартных сывороток строят калибровочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией Ig и диаметром колец преципитации. Для этого на полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат известное количество Ig (МЕ/мл или мг/мл), содержащихся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.
Для определения уровня Ig в молочной сыворотке на оси
абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации Ig каждого класса, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.
Химический метод по Бадин и Раусселет
Подготовка к анализу
1) Приготовление цинк-салицилового реактива. 1,875 сульфата цинка растворяют в бидистиллированной воде, вносят 57,14 г салицилового натрия, доливают 900 мл бидистиллированной воды. Раствор доводят до рН 7,3 0,1 н раствором едкого натра, затем - до 1 л бидистиллированной водой.
2) Приготовление раствора кальция хлорида. 2 мл официнального 10% раствора кальция хлорида (фиксанала) смешивают со 117 мл бидистиллированной воды.
3) Приготовление тимолового реактива. Готовят 10% раствор тимола на 96° спирте, затем 1 мл спиртового раствора растворяют в 80 мл веронал-мединалового буфера, встряхивают и доводят до 100 мл.
4) Приготовление веронал-мединалового буфера. 2,76 г веронала растворяют в 1 литровой колбе в небольшом количестве бидистиллированной воды, затем прибавляют 2,06 г мединала, доводят рН до 7,5 вероналом или мединалом, затем - до 1 л бидистиллированной водой.
5) Приготовление цинкового реактива. 0,28 г веронала, 0,21 г мединала и 0,024 г сульфата цинка растворяют в 1 л бидистиллированной воды и доводят рН до 7,5 вероналом или мединалом.
6) Приготовление раствора сернокислого аммония. 189,0 г сернокислого аммония и 29,3 г натрия хлорида растворяют в 1 л бидистиллированной воды.
7) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную или соляную кислоту по каплям, доводя рН до 4,6. Казеин отделяют центри-
