фугированием, сыворотку фильтруют через бумажный фильтр, рН доводят до 7,2-7,3 0,1н раствором едкого натра.
8) Построение калибровочных кривых. Используют эталонные сыворотки с известным содержанием IgA, G и M. К 1 мл эталонной сыворотки добавляют 1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают. 1 мл добавляют к 1 мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физиологическом растворе колориметрическим методом при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр) и строят калибровочные кривые зависимости величины оптической плотности от концентрации Ig А, G и М.
Проведение анализа
1) Определение IgG. В пробирку № 1 вносят 5 мл цинксалицилового реактива, добавляют 1,1 мл молочной сыворотки, выдерживают 1 мин и колориметрируют.
В пробирку № 2 вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют.
2) Определение IgМ. В пробирку № 3 вносят 6 мл цинкового реактива, добавляют 0,05 мл сыворотки и колориметрируют.
3) Определение IgА. В пробирку № 4 вносят 6 мл сернокислого аммония, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют.
Обработка результатов
Для каждого класса Ig проводят расчёт оптической плотности исследуемых растворов по калибровочной кривой.
� Ig G
ДG = Д2 × 2 + Д1 , где
ДG – оптическая плотность IgG;
Д2 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 2;
Д1 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 1;
2 – коэффициент.
� IgМ
Дм = Д3 × 2 , где
Дм – оптическая плотность IgМ;
Д3 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 3;
2 – коэффициент.
� IgА
Да = Д4 × 2 , где
Да – оптическая плотность IgА;
Д4 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;
2 – коэффициент.
Определение лактоферрина
В основу положен метод Манчини: измерение диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки молока в луночки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3% гель агара «Дифко», приготовленный на 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объёмом антисыворотки, разведённой в 60 раз и нагретой до этой же температуры, и выливают на стеклянную пластину. Предварительно на пластину помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластину, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.
2) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.
3) Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика используют стандартный ЛФ в кон-
центрациях 175, 350, 700, 1400, 2800 мкг/мл, разведённый в 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия.
Проведение анализа
В слое агара с антисывороткой пробойником вырезают рядами лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят по 2 мкл разведения стандартного ЛФ. Лунки следующих рядов заполняют исследуемыми молочными сыворотками в том же объёме. Агаровые платины выдерживают при комнатной температуре 18-20°С во влажной среде в течение 48 ч, затем окрашивают амидочерным Б.
Обработка результатов
Измеряют диаметры колец преципитации. Строят калибровочный график зависимости логарифма концентрации стандартного ЛФ в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации с антисывороткой. На полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартным ЛФ, а по оси ординат известное количество ЛФ, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Определение концентрации ЛФ в испытуемых молочных сыворотках определяют с помощью калибровочного графика.
Определение активности ЛПО
Метод Б.П. Плешкова
Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина с перекисью водорода при участии ЛПО с образованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520 нм.
Подготовка к анализу
1) Приготовление 2,5 мм раствора бензидина. 184,2 мг бензидина растворяют в смеси 100 мл дистиллированной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нём 5,45 г трёхводного уксуснокислого натрия и доводят общий объём раствора дистиллированной водой до 400 мл.
2) Приготовление 0,333н перекиси водорода. К 0,6 мл пе-
