Д3 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 3;

2 – коэффициент.

� IgА

Да = Д4 × 2 , где

Да – оптическая плотность IgА;

Д4 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;

2 – коэффициент.

Определение лактоферрина

В основу положен метод Манчини: измерение диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки молока в луночки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.

Подготовка к анализу

1) Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3% гель агара «Дифко», приготовленный на 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объёмом антисыворотки, разведённой в 60 раз и нагретой до этой же температуры, и выливают на стеклянную пластину. Предварительно на пластину помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластину, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.

2) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

3) Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика используют стандартный ЛФ в кон-

центрациях 175, 350, 700, 1400, 2800 мкг/мл, разведённый в 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия.

Проведение анализа

В слое агара с антисывороткой пробойником вырезают рядами лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят по 2 мкл разведения стандартного ЛФ. Лунки следующих рядов заполняют исследуемыми молочными сыворотками в том же объёме. Агаровые платины выдерживают при комнатной температуре 18-20°С во влажной среде в течение 48 ч, затем окрашивают амидочерным Б.

Обработка результатов

Измеряют диаметры колец преципитации. Строят калибровочный график зависимости логарифма концентрации стандартного ЛФ в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации с антисывороткой. На полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартным ЛФ, а по оси ординат известное количество ЛФ, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Определение концентрации ЛФ в испытуемых молочных сыворотках определяют с помощью калибровочного графика.

Определение активности ЛПО

Метод Б.П. Плешкова

Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина с перекисью водорода при участии ЛПО с образованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520 нм.

Подготовка к анализу

1) Приготовление 2,5 мм раствора бензидина. 184,2 мг бензидина растворяют в смеси 100 мл дистиллированной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нём 5,45 г трёхводного уксуснокислого натрия и доводят общий объём раствора дистиллированной водой до 400 мл.

2) Приготовление 0,333н перекиси водорода. К 0,6 мл пе-

рекиси водорода добавляют 99,4 мл дистиллированной воды. Концентрацию перекиси определяют титрованием 0,1н раствором перманганата калия (KMnO4). На титрование 3,0 мл 0,333н перекиси водорода должно пойти 10,0 мл 0,1н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водорода доводят до нужной концентрации дистиллированной водой.

3) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем, молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа

В термостатируемую кювету с рабочей длиной 10 мм наливают 2,0 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до температуры 37°С. Содержимое кюветы, перемешивают и устанавливают на спектрофотометре при длине волны 520 нм нулевую отметку шкалы оптической плотности. Затем в кювету добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, перемешивают и ровно через 60 сек определяют оптическую плотность. Аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной пробы, содержащей вместо сыворотки молока 0,1 мл дистиллированной воды.

Обработка результатов

Активность ЛПО выражают в условных единицах активности (УЕА) и рассчитывают по формуле:

УЕА = ( Е0 - Ек ) × 10 / 60 , где

УЕА – активность фермента, Ед.ОП/мл; Е0 – оптическая плотность опытной пробы; Ек – оптическая плотность контрольной пробы; 10 – коэффициент пересчета в 1 мл;

60 – время проведения реакции, сек;

1 УЕА – изменение оптической плотности на 0,01 за 1 сек

1 мл сыворотки молока.