рН 8,6. Агар, смешанный с моноспецифической антисывороткой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластинах размером 9х12 см. Для этого на пластинку помещают латунную или пластмассовую П-образную рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинами заливают смесью агара и антисыворотки в количестве 9 мл.
2) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центрифугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
Проведение анализа
В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят по 2 мкл стандартной неразведённой и разведённой 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моноспецифической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сывороткой объёмом по 2 мкл. Пластины инкубируют во влажной камере при температуре 4°С в течение 24 ч, а пластины с антисывороткой к IgМ – 48 ч.
Обработка результатов
После окончания инкубации измеряют диаметр колец преципитации. По данным разведений стандартных сывороток строят калибровочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией Ig и диаметром колец преципитации. Для этого на полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат известное количество Ig (МЕ/мл или мг/мл), содержащихся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.
Для определения уровня Ig в молочной сыворотке на оси
абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации Ig каждого класса, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.
Химический метод по Бадин и Раусселет
Подготовка к анализу
1) Приготовление цинк-салицилового реактива. 1,875 сульфата цинка растворяют в бидистиллированной воде, вносят 57,14 г салицилового натрия, доливают 900 мл бидистиллированной воды. Раствор доводят до рН 7,3 0,1 н раствором едкого натра, затем - до 1 л бидистиллированной водой.
2) Приготовление раствора кальция хлорида. 2 мл официнального 10% раствора кальция хлорида (фиксанала) смешивают со 117 мл бидистиллированной воды.
3) Приготовление тимолового реактива. Готовят 10% раствор тимола на 96° спирте, затем 1 мл спиртового раствора растворяют в 80 мл веронал-мединалового буфера, встряхивают и доводят до 100 мл.
4) Приготовление веронал-мединалового буфера. 2,76 г веронала растворяют в 1 литровой колбе в небольшом количестве бидистиллированной воды, затем прибавляют 2,06 г мединала, доводят рН до 7,5 вероналом или мединалом, затем - до 1 л бидистиллированной водой.
5) Приготовление цинкового реактива. 0,28 г веронала, 0,21 г мединала и 0,024 г сульфата цинка растворяют в 1 л бидистиллированной воды и доводят рН до 7,5 вероналом или мединалом.
6) Приготовление раствора сернокислого аммония. 189,0 г сернокислого аммония и 29,3 г натрия хлорида растворяют в 1 л бидистиллированной воды.
7) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную или соляную кислоту по каплям, доводя рН до 4,6. Казеин отделяют центри-
фугированием, сыворотку фильтруют через бумажный фильтр, рН доводят до 7,2-7,3 0,1н раствором едкого натра.
8) Построение калибровочных кривых. Используют эталонные сыворотки с известным содержанием IgA, G и M. К 1 мл эталонной сыворотки добавляют 1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают. 1 мл добавляют к 1 мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физиологическом растворе колориметрическим методом при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр) и строят калибровочные кривые зависимости величины оптической плотности от концентрации Ig А, G и М.
Проведение анализа
1) Определение IgG. В пробирку № 1 вносят 5 мл цинксалицилового реактива, добавляют 1,1 мл молочной сыворотки, выдерживают 1 мин и колориметрируют.
В пробирку № 2 вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют.
2) Определение IgМ. В пробирку № 3 вносят 6 мл цинкового реактива, добавляют 0,05 мл сыворотки и колориметрируют.
3) Определение IgА. В пробирку № 4 вносят 6 мл сернокислого аммония, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют.
Обработка результатов
Для каждого класса Ig проводят расчёт оптической плотности исследуемых растворов по калибровочной кривой.
� Ig G
ДG = Д2 × 2 + Д1 , где
ДG – оптическая плотность IgG;
Д2 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 2;
Д1 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 1;
2 – коэффициент.
� IgМ
Дм = Д3 × 2 , где
Дм – оптическая плотность IgМ;
