зоцим разводят в 1/15М фосфатном буфере до концентраций 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.
Проведение анализа
Растворы стандартного лизоцима и пробы молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,05 мл. Кюветы с образцами выдерживают 48 ч во влажной камере при комнатной температуре 22-24°С, а затем линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов
По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую в полулогарифмическом масштабе и с её помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.
Метод Оссермана в модификации Фараджи
Подготовка к анализу
1) Приготовление агаровых пластинок. 1% раствор агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере с рН 6,2 расплавляют 15-20 мин на водяной бане. В охлажденный до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-культуры Mycrococcus lysodeicticus из расчета 50 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в чашки Петри так, чтобы получился слой агара толщиной 4 мм. После застывания агара в нём делают луночки диаметром 1 см на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока. Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 24 ч, снимают верхний слой с жиром и разводят 1/15М фосфатным буфером в соотношении 1:10.
3) Приготовление растворов лизоцима. Стандартный лизоцим разводят в 1/15М фосфатном буфере до концентрации 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.
Проведение анализа
Растворы стандартного лизоцима и пробы разведенного молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,1 мл, выдерживают в термостате при 37°С в течение 36 ч и линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов
По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую и с её помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.
Определение общих иммуноглобулинов Методом с сульфатом натрия
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока (молозива) центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира, который легко отделяют проволочной петлей или шпателем. Обезжиренное молозиво разводят дистиллированной водой в 5-10 раз, подогревают до температуры 37°С и добавляют по каплям 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Полученную сыворотку молока (молозива) фильтруют через бумажный фильтр и используют для анализа.
2) Приготовление 18% раствора сульфата натрия. 18 г обезвоженного сульфата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в посуде с притёртой крышкой.
Проведение анализа
В пробирку вносят 1,9 мл 18% раствора сульфата натрия, добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки молока (молозива), тщательно перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 400±5 нм в кювете с рабочей гранью 5 мм относительно чистого раствора сульфата цинка. В случае получения оптической плотности выше отметок 1,300-1,500 сыворотку разбавляют физиологическим раствором в 2-3 раза. Степень разведения учитывают при расчёте конечных результатов.
Обработка результатов
По данным оптической плотности образцов сыворотки молока (молозива) с учётом степени разведения определяют концентрацию иммунных глобулинов по калибровочной таблице 8.
Таблица 8 – Калибровочная таблица содержания иммунных глобулинов в молоке (молозиве)
| Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л | Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л | Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л |
|---|---|---|---|---|---|
| 0,01 | 12,0 | 0,15 | 191,0 | 0,65 | 730,0 |
| 0,02 | 28,0 | 0,16 | 203,0 | 0,70 | 790,0 |
| 0,03 | 35,0 | 0,17 | 214,0 | 0,75 | 840,0 |
| 0,04 | 46,0 | 0,18 | 225,0 | 0,80 | 890,0 |
| 0,05 | 57,0 | 0,19 | 236,0 | 0,85 | 950,0 |
| 0,06 | 69,0 | 0,20 | 247,0 | 0,90 | 1010,0 |
| 0,07 | 80,0 | 0,25 | 290,0 | 0,95 | 1060,0 |
| 0,08 | 91,0 | 0,30 | 340,0 | 1,05 | 1170,0 |
| 0,09 | 103,0 | 0,35 | 400,0 | 1,10 | 1230,0 |
| 0,10 | 114,0 | 0,40 | 450,0 | 1,15 | 1290,0 |
| 0,11 | 130,0 | 0,45 | 500,0 | 1,20 | 1340,0 |
| 0,12 | 146,0 | 0,50 | 570,0 | 1,25 | 1400,0 |
| 0,13 | 157,0 | 0,55 | 620,0 | 1,30 | 1450,0 |
| 0,14 | 179,0 | 0,60 | 680,0 |
Количественное определение иммуноглобулинов Метод радиальной иммунодиффузии
В основу положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой молочной сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к IgА, IgG, IgМ. 3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 смешивают нагретым до температуры 56°С в соотношении 1:1 с моноспецифической антисывороткой, в которой концентрация антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведения антисыворотки делают на 0,1М веронал-мединаловом буфере с
