В качестве тест-культуры используют белый стрептококк штамма 22. Максимальные концентрации ЛК обнаруживаются в молозиве, через 10 дней после отёла регистрируется ниже уровня ЛМ.
� Лизоцим термостабильный - ЛТ
В качестве тест-культуры используют золотистый стафилококк штамма ВМ-57. Выявляется в молоке стародойных коров после прогревания при температуре 70°С в течение 30 мин и сохраняется до 1,5-2,0 мес., в сыром молоке сохраняется 5-7 дней.
� Лизоцим инверсионный - ЛИ
В качестве тест-культуры используют розовый стафилококк штамма 56. Отсутствует в молоке здоровых коров, обнаруживается в секрете поражённых маститом долей вымени.
� Лизоцим основной - ЛО
В качестве тест-культуры используют ацидофильную палочку штамма 17т. Определяют методом серийных разведений. В разведения молока (молозива) вносят 10% суточную бульонную тест-культуру, выдерживают в термостате при температуре 37°С в течение суток, затем учитывают рост. В молозиве ЛО проявляет бактерицидное действие в разведении 1:10000, на 10-й день после отёла в молоке его антибактериальная активность проявляется в разведении 1:2-1:4, а у больных маститом коров несколько повышается.
Определение истинного лизоцима (мурамидазы) Метод К. Шахани
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. 5 мл молока разводят равным объёмом 0,5% раствора натрия хлорида и центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин. Снимают слой жира, молоко подогревают до 37°С и доводят рН до 4,6 1н раствором соляной кислоты. Выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
2) Построение калибровочных кривых. Для построения калибровочных кривых используют кипячёное молоко, в котором таким способом подавляется лизоцимная активность, а
затем из него готовят молочную сыворотку.
В качестве тест-культуры используют убитых ультрафиолетовыми лучами и лиофилизированных клеток Mycrococcus lysodeicticus, из которых готовят суспензию на 1/15М фосфатном буфере с рН 6,2, при этом экстинкция должна составлять 10-90% против дистиллированной воды (100%).
В два ряда пробирок с сывороткой молока по 3 мл вносят разные количества лизоцима (в первый ряд от 0 до 20 мкг/100 мл, во второй - от 20 до 200 мкг/100 мл), затем добавляют по 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и на спектрофотометре определяют экстинкцию (Д0) при длине волны 540 нм. После этого смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинкцию (Д20). По разности экстинкций (Д0 и Д20) смеси отдельных пробирок и соответствия ей концентрации лизоцима строят две калибровочные кривые.
Проведение анализа
К 3 мл сыворотки исследуемого молока добавляют 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и сразу же определяют на спектрофотометре экстинкцию (Д0) при длине волны 540 нм. Затем смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинкцию (Д20).
Обработка результатов
По разности экстинкций Д0 и Д20 по калибровочной кривой определяют концентрацию лизоцима.
Метод Парри в модификации Хавигера
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. 5 мл молока центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, снимают слой жира, подогревают до 37°С и осаждают казеин, доводя рН до 4,6 путём внесения 1н раствора соляной кислоты. Казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1.
2) Приготовление суспензии тест-культуры. Используют ацетоновый порошок убитой культуры Mycrococcus
lysodeicticus, который вносят в 1/5М фосфатный буфер с рН 6,2 до конечной оптической плотности 0,65-0,70, которая не изменяется при комнатной температуре в течение 30 мин.
Проведение анализа
К 1 мл суспензии тест-культуры добавляют 1 мл разведённой физиологическим раствором сыворотки молока, быстро перемешивают и измеряют оптическую плотность Д0 на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Затем пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова определяют оптическую плотность (Д30).
Обработка результатов
Активность лизоцима выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:
УЕА = (Д0 – Д30) / 30 , где
Д0 - начальная оптическая плотность образца; Д30 - оптическая плотность через 30 мин;
30 - время инкубации образца в термостате, мин.
1 УЕА - изменение оптической плотности на 1 единицу за 1 мин 1 мл сыворотки молока.
Метод П.А. Емельяненко и др.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агаровых пластинок. 1% раствор агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере расплавляют 15-20 мин на кипящей водяной бане. В охлаждённый до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-микроба Mycrococcus lysodeicticus из расчета 20 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в прямоугольные кюветы из органического стекла размером 30х17х1,5 см так, чтобы получился слой агара толщиной 4 см. После застывания в агаре с помощью тонкостенной металлической трубочки с наружным диаметром 5 мм делают луночки на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока. Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 12-14 ч и снимают верхний слой с жиром.
3) Приготовление растворов лизоцима. Стандартный ли-
