центрациях 175, 350, 700, 1400, 2800 мкг/мл, разведённый в 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия.

Проведение анализа

В слое агара с антисывороткой пробойником вырезают рядами лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят по 2 мкл разведения стандартного ЛФ. Лунки следующих рядов заполняют исследуемыми молочными сыворотками в том же объёме. Агаровые платины выдерживают при комнатной температуре 18-20°С во влажной среде в течение 48 ч, затем окрашивают амидочерным Б.

Обработка результатов

Измеряют диаметры колец преципитации. Строят калибровочный график зависимости логарифма концентрации стандартного ЛФ в различной концентрации от квадрата диаметра колец преципитации с антисывороткой. На полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартным ЛФ, а по оси ординат известное количество ЛФ, содержащееся в каждом разведении. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Определение концентрации ЛФ в испытуемых молочных сыворотках определяют с помощью калибровочного графика.

Определение активности ЛПО

Метод Б.П. Плешкова

Метод основан на определении скорости реакции окисления бензидина с перекисью водорода при участии ЛПО с образованием вещества, имеющего максимум поглощения при 520 нм.

Подготовка к анализу

1) Приготовление 2,5 мм раствора бензидина. 184,2 мг бензидина растворяют в смеси 100 мл дистиллированной воды и 2,3 мл ледяной уксусной кислоты. После полного растворения бензидина раствор охлаждают, растворяют в нём 5,45 г трёхводного уксуснокислого натрия и доводят общий объём раствора дистиллированной водой до 400 мл.

2) Приготовление 0,333н перекиси водорода. К 0,6 мл пе-

рекиси водорода добавляют 99,4 мл дистиллированной воды. Концентрацию перекиси определяют титрованием 0,1н раствором перманганата калия (KMnO4). На титрование 3,0 мл 0,333н перекиси водорода должно пойти 10,0 мл 0,1н раствора перманганата калия. По результатам титрования раствор перекиси водорода доводят до нужной концентрации дистиллированной водой.

3) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем, молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа

В термостатируемую кювету с рабочей длиной 10 мм наливают 2,0 мл раствора бензидина и 0,5 мл раствора перекиси водорода, предварительно подогретых до температуры 37°С. Содержимое кюветы, перемешивают и устанавливают на спектрофотометре при длине волны 520 нм нулевую отметку шкалы оптической плотности. Затем в кювету добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, перемешивают и ровно через 60 сек определяют оптическую плотность. Аналогично опытной пробе проводят измерение оптической плотности контрольной пробы, содержащей вместо сыворотки молока 0,1 мл дистиллированной воды.

Обработка результатов

Активность ЛПО выражают в условных единицах активности (УЕА) и рассчитывают по формуле:

УЕА = ( Е0 - Ек ) × 10 / 60 , где

УЕА – активность фермента, Ед.ОП/мл; Е0 – оптическая плотность опытной пробы; Ек – оптическая плотность контрольной пробы; 10 – коэффициент пересчета в 1 мл;

60 – время проведения реакции, сек;

1 УЕА – изменение оптической плотности на 0,01 за 1 сек

1 мл сыворотки молока.

Модифицированный метод Орама и Рейтера Подготовка к анализу

1) Приготовление 0,1М фосфатного буфера (рН=6,7). 6,8 г двузамещённого фосфорнокислого калия (КН2РО4) растворяют в 500 мл дистиллированной воды. 11,4 г трёхводного однозамещённого фосфорнокислого калия (К2НРО4 ×3H2O) растворяют в 500 мл дистиллированной воды. В раствор КН2РО4 под контролем рН-метра приливают раствор К2НРО4 до рН 6,7.

2) Приготовление 0,01% раствора орто-дианизидина. 10 мг орто-дианизидина растворяют в 100 мл 0,1М фосфатного буфера рН 6,7.

3) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем, молоко нагревают до 37°С. Добавляют на кончике скальпеля сычужный фермент, выпавший в осадок казеин отделяют центрифугированием, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

Проведение анализа

К 3 мл 0,01% раствора орто-дианизидина добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки молока, тщательно перемешивают и определяют экстинкцию на спектрофотометре при длине волны 460 нм с рабочей длиной кюветы 10 мм. Затем в кювету доливают 0,1 мл 9 мМ перекиси водорода, хорошо перемешивают и выдерживают в водяной бане или термостате при температуре 37°С 5 мин. Снова измеряют экстинкцию при той же длине волны.

Обработка результатов

Активность ЛПО выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:

УЕА = ( Д0 – Д5 ) / 5 , где

Д0 – начальная экстинкция молока;

Д5 – экстинкция через 5 мин;

5 – время инкубации образца при температуре 37°С, мин;

1 УЕА – изменение экстинкции на 0,001 единицы за 1 мин 1 мл сыворотки молока.