абсцисс откладывают диаметр кольца преципитации, затем восстанавливают перпендикуляр до пересечения с кривой и точку пересечения проектируют на ось ординат. Полученное значение соответствует концентрации Ig каждого класса, выраженной в МЕ/мл или мг/мл.

Химический метод по Бадин и Раусселет

Подготовка к анализу

1) Приготовление цинк-салицилового реактива. 1,875 сульфата цинка растворяют в бидистиллированной воде, вносят 57,14 г салицилового натрия, доливают 900 мл бидистиллированной воды. Раствор доводят до рН 7,3 0,1 н раствором едкого натра, затем - до 1 л бидистиллированной водой.

2) Приготовление раствора кальция хлорида. 2 мл официнального 10% раствора кальция хлорида (фиксанала) смешивают со 117 мл бидистиллированной воды.

3) Приготовление тимолового реактива. Готовят 10% раствор тимола на 96° спирте, затем 1 мл спиртового раствора растворяют в 80 мл веронал-мединалового буфера, встряхивают и доводят до 100 мл.

4) Приготовление веронал-мединалового буфера. 2,76 г веронала растворяют в 1 литровой колбе в небольшом количестве бидистиллированной воды, затем прибавляют 2,06 г мединала, доводят рН до 7,5 вероналом или мединалом, затем - до 1 л бидистиллированной водой.

5) Приготовление цинкового реактива. 0,28 г веронала, 0,21 г мединала и 0,024 г сульфата цинка растворяют в 1 л бидистиллированной воды и доводят рН до 7,5 вероналом или мединалом.

6) Приготовление раствора сернокислого аммония. 189,0 г сернокислого аммония и 29,3 г натрия хлорида растворяют в 1 л бидистиллированной воды.

7) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин. Ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Жир снимают с помощью шпателя, снятое молоко подогревают до 37°С и добавляют уксусную или соляную кислоту по каплям, доводя рН до 4,6. Казеин отделяют центри-

фугированием, сыворотку фильтруют через бумажный фильтр, рН доводят до 7,2-7,3 0,1н раствором едкого натра.

8) Построение калибровочных кривых. Используют эталонные сыворотки с известным содержанием IgA, G и M. К 1 мл эталонной сыворотки добавляют 1 мл физиологического раствора, тщательно перемешивают. 1 мл добавляют к 1 мл физиологического раствора и т.д. до 7-й пробирки. Затем определяют оптическую плотность полученного разведения сывороток в физиологическом растворе колориметрическим методом при длине волны 400-470 нм (синий светофильтр) и строят калибровочные кривые зависимости величины оптической плотности от концентрации Ig А, G и М.

Проведение анализа

1) Определение IgG. В пробирку № 1 вносят 5 мл цинксалицилового реактива, добавляют 1,1 мл молочной сыворотки, выдерживают 1 мин и колориметрируют.

В пробирку № 2 вносят 6 мл тимолового реактива, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют.

2) Определение IgМ. В пробирку № 3 вносят 6 мл цинкового реактива, добавляют 0,05 мл сыворотки и колориметрируют.

3) Определение IgА. В пробирку № 4 вносят 6 мл сернокислого аммония, добавляют 0,05 мл молочной сыворотки и колориметрируют.

Обработка результатов

Для каждого класса Ig проводят расчёт оптической плотности исследуемых растворов по калибровочной кривой.

� Ig G

ДG = Д2 × 2 + Д1 , где

ДG – оптическая плотность IgG;

Д2 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 2;

Д1 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 1;

2 – коэффициент.

� IgМ

Дм = Д3 × 2 , где

Дм – оптическая плотность IgМ;

Д3 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 3;

2 – коэффициент.

� IgА

Да = Д4 × 2 , где

Да – оптическая плотность IgА;

Д4 – оптическая плотность раствора молочной сыворотки в пробирке № 4;

2 – коэффициент.

Определение лактоферрина

В основу положен метод Манчини: измерение диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки молока в луночки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована специфическая антисыворотка.

Подготовка к анализу

1) Приготовление агара со специфической антисывороткой. Свежий 3% гель агара «Дифко», приготовленный на 0,033М фосфатном буфере с рН 8,0, содержащим 0,1М поваренной соли и 0,01% мертиолята натрия, охлаждают до 52°С, смешивают с равным объёмом антисыворотки, разведённой в 60 раз и нагретой до этой же температуры, и выливают на стеклянную пластину. Предварительно на пластину помещают П-образную латунную или пластмассовую рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластину, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между стеклянными пластинами заливают смесью агара с антисывороткой.

2) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и молоко нагревают до 37°С. Затем добавляют сычужный фермент на кончике скальпеля, выпавший осадок казеина центрифугируют, а сыворотку молока фильтруют через бумажный фильтр.

3) Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика используют стандартный ЛФ в кон-