По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую и с её помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.
Определение общих иммуноглобулинов Методом с сульфатом натрия
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока (молозива) центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира, который легко отделяют проволочной петлей или шпателем. Обезжиренное молозиво разводят дистиллированной водой в 5-10 раз, подогревают до температуры 37°С и добавляют по каплям 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Полученную сыворотку молока (молозива) фильтруют через бумажный фильтр и используют для анализа.
2) Приготовление 18% раствора сульфата натрия. 18 г обезвоженного сульфата натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранят в посуде с притёртой крышкой.
Проведение анализа
В пробирку вносят 1,9 мл 18% раствора сульфата натрия, добавляют 0,1 мл испытуемой сыворотки молока (молозива), тщательно перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при длине волны 400±5 нм в кювете с рабочей гранью 5 мм относительно чистого раствора сульфата цинка. В случае получения оптической плотности выше отметок 1,300-1,500 сыворотку разбавляют физиологическим раствором в 2-3 раза. Степень разведения учитывают при расчёте конечных результатов.
Обработка результатов
По данным оптической плотности образцов сыворотки молока (молозива) с учётом степени разведения определяют концентрацию иммунных глобулинов по калибровочной таблице 8.
Таблица 8 – Калибровочная таблица содержания иммунных глобулинов в молоке (молозиве)
| Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л | Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л | Оптиче- ская плот- ность | Содержа- ние Ig, г/л |
|---|---|---|---|---|---|
| 0,01 | 12,0 | 0,15 | 191,0 | 0,65 | 730,0 |
| 0,02 | 28,0 | 0,16 | 203,0 | 0,70 | 790,0 |
| 0,03 | 35,0 | 0,17 | 214,0 | 0,75 | 840,0 |
| 0,04 | 46,0 | 0,18 | 225,0 | 0,80 | 890,0 |
| 0,05 | 57,0 | 0,19 | 236,0 | 0,85 | 950,0 |
| 0,06 | 69,0 | 0,20 | 247,0 | 0,90 | 1010,0 |
| 0,07 | 80,0 | 0,25 | 290,0 | 0,95 | 1060,0 |
| 0,08 | 91,0 | 0,30 | 340,0 | 1,05 | 1170,0 |
| 0,09 | 103,0 | 0,35 | 400,0 | 1,10 | 1230,0 |
| 0,10 | 114,0 | 0,40 | 450,0 | 1,15 | 1290,0 |
| 0,11 | 130,0 | 0,45 | 500,0 | 1,20 | 1340,0 |
| 0,12 | 146,0 | 0,50 | 570,0 | 1,25 | 1400,0 |
| 0,13 | 157,0 | 0,55 | 620,0 | 1,30 | 1450,0 |
| 0,14 | 179,0 | 0,60 | 680,0 |
Количественное определение иммуноглобулинов Метод радиальной иммунодиффузии
В основу положен метод Манчини, который основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой молочной сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуноглобулинов определяют относительно стандартной сыворотки с известной концентрацией иммуноглобулинов.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агара с моноспецифической антисывороткой к IgА, IgG, IgМ. 3% агар «Дифко» или агарозу на 0,1М веронал-мединаловом буфере с рН 8,6 смешивают нагретым до температуры 56°С в соотношении 1:1 с моноспецифической антисывороткой, в которой концентрация антител вдвое превышает рабочий титр (указанный на этикетке). Разведения антисыворотки делают на 0,1М веронал-мединаловом буфере с
рН 8,6. Агар, смешанный с моноспецифической антисывороткой, распределяют равномерным слоем на стеклянных пластинах размером 9х12 см. Для этого на пластинку помещают латунную или пластмассовую П-образную рамку толщиной 1 мм, сверху помещают вторую стеклянную пластинку, смоченную гидрофобной жидкостью, и пространство между пластинами заливают смесью агара и антисыворотки в количестве 9 мл.
2) Приготовление молочной сыворотки. Пробу молока центрифугируют в течение 15 мин при 2000 об/мин, ставят в морозильную камеру холодильника на 20-30 мин для застывания жира. Слой жира удаляют шпателем и центрифугат нагревают до 37°С. Затем по каплям добавляют 10% раствор уксусной кислоты, доводя рН до 4,6 для осаждения казеина. Казеин осаждают центрифугированием, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр.
Проведение анализа
В слое агара с моноспецифической антисывороткой пробойником вырезают рядом две лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15 мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят по 2 мкл стандартной неразведённой и разведённой 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моноспецифической сыворотки. Лунки следующих рядов заполняют испытуемой молочной сывороткой объёмом по 2 мкл. Пластины инкубируют во влажной камере при температуре 4°С в течение 24 ч, а пластины с антисывороткой к IgМ – 48 ч.
Обработка результатов
После окончания инкубации измеряют диаметр колец преципитации. По данным разведений стандартных сывороток строят калибровочные кривые, выражающие зависимость между концентрацией Ig и диаметром колец преципитации. Для этого на полулогарифмической бумаге по оси абсцисс откладывают диаметры колец преципитации стандартной сыворотки, а по оси ординат известное количество Ig (МЕ/мл или мг/мл), содержащихся в стандартной сыворотке каждого разведения. Образующиеся точки соединяют прямой линией. Для каждого класса иммуноглобулинов строят отдельный график.
Для определения уровня Ig в молочной сыворотке на оси
