затем из него готовят молочную сыворотку.
В качестве тест-культуры используют убитых ультрафиолетовыми лучами и лиофилизированных клеток Mycrococcus lysodeicticus, из которых готовят суспензию на 1/15М фосфатном буфере с рН 6,2, при этом экстинкция должна составлять 10-90% против дистиллированной воды (100%).
В два ряда пробирок с сывороткой молока по 3 мл вносят разные количества лизоцима (в первый ряд от 0 до 20 мкг/100 мл, во второй - от 20 до 200 мкг/100 мл), затем добавляют по 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и на спектрофотометре определяют экстинкцию (Д0) при длине волны 540 нм. После этого смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинкцию (Д20). По разности экстинкций (Д0 и Д20) смеси отдельных пробирок и соответствия ей концентрации лизоцима строят две калибровочные кривые.
Проведение анализа
К 3 мл сыворотки исследуемого молока добавляют 3 мл свежеприготовленной клеточной суспензии тест-культуры и сразу же определяют на спектрофотометре экстинкцию (Д0) при длине волны 540 нм. Затем смесь инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 20 мин и повторно определяют экстинкцию (Д20).
Обработка результатов
По разности экстинкций Д0 и Д20 по калибровочной кривой определяют концентрацию лизоцима.
Метод Парри в модификации Хавигера
Подготовка к анализу
1) Приготовление молочной сыворотки. 5 мл молока центрифугируют 10 мин при 2000 об/мин, снимают слой жира, подогревают до 37°С и осаждают казеин, доводя рН до 4,6 путём внесения 1н раствора соляной кислоты. Казеин отделяют центрифугированием в течение 10 мин при 2000 об/мин, а сыворотку фильтруют через бумажный фильтр и разводят физиологическим раствором в соотношении 1:1.
2) Приготовление суспензии тест-культуры. Используют ацетоновый порошок убитой культуры Mycrococcus
lysodeicticus, который вносят в 1/5М фосфатный буфер с рН 6,2 до конечной оптической плотности 0,65-0,70, которая не изменяется при комнатной температуре в течение 30 мин.
Проведение анализа
К 1 мл суспензии тест-культуры добавляют 1 мл разведённой физиологическим раствором сыворотки молока, быстро перемешивают и измеряют оптическую плотность Д0 на спектрофотометре при длине волны 540 нм в кювете с рабочей длиной 1 см. Затем пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин, после чего снова определяют оптическую плотность (Д30).
Обработка результатов
Активность лизоцима выражают в условных единицах активности (УЕА) и определяют по формуле:
УЕА = (Д0 – Д30) / 30 , где
Д0 - начальная оптическая плотность образца; Д30 - оптическая плотность через 30 мин;
30 - время инкубации образца в термостате, мин.
1 УЕА - изменение оптической плотности на 1 единицу за 1 мин 1 мл сыворотки молока.
Метод П.А. Емельяненко и др.
Подготовка к анализу
1) Приготовление агаровых пластинок. 1% раствор агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере расплавляют 15-20 мин на кипящей водяной бане. В охлаждённый до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-микроба Mycrococcus lysodeicticus из расчета 20 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в прямоугольные кюветы из органического стекла размером 30х17х1,5 см так, чтобы получился слой агара толщиной 4 см. После застывания в агаре с помощью тонкостенной металлической трубочки с наружным диаметром 5 мм делают луночки на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока. Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 12-14 ч и снимают верхний слой с жиром.
3) Приготовление растворов лизоцима. Стандартный ли-
зоцим разводят в 1/15М фосфатном буфере до концентраций 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.
Проведение анализа
Растворы стандартного лизоцима и пробы молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,05 мл. Кюветы с образцами выдерживают 48 ч во влажной камере при комнатной температуре 22-24°С, а затем линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов
По данным зон лизиса растворами стандартного лизоцима строят калибровочную кривую в полулогарифмическом масштабе и с её помощью определяют концентрацию лизоцима в исследуемых пробах молока.
Метод Оссермана в модификации Фараджи
Подготовка к анализу
1) Приготовление агаровых пластинок. 1% раствор агара «Дифко» на 1/15М фосфатном буфере с рН 6,2 расплавляют 15-20 мин на водяной бане. В охлажденный до 60-70°С раствор вносят ацетоновый порошок тест-культуры Mycrococcus lysodeicticus из расчета 50 мг на 100 мл среды и перемешивают до получения однородной смеси. Смесь разливают в чашки Петри так, чтобы получился слой агара толщиной 4 мм. После застывания агара в нём делают луночки диаметром 1 см на расстоянии 1,5 см друг от друга.
2) Приготовление обезжиренного молока. Пробу молока (2-5 мл) выдерживают в холодильнике при температуре 4-6°С в течение 24 ч, снимают верхний слой с жиром и разводят 1/15М фосфатным буфером в соотношении 1:10.
3) Приготовление растворов лизоцима. Стандартный лизоцим разводят в 1/15М фосфатном буфере до концентрации 1, 3, 5, 10, 20, 40 и 70 мкг/мл.
Проведение анализа
Растворы стандартного лизоцима и пробы разведенного молока вносят в луночки агаровой пластинки в количестве по 0,1 мл, выдерживают в термостате при 37°С в течение 36 ч и линейкой измеряют диаметры зон лизиса.
Обработка результатов
