первичном диагностировании, бактериологическими и биологическими методами исследования.
B необходимых случаях рекомендуется использовать методы обогащения исследуемого материала путем флотации и седиментации, что значительно повышает вероятность обнаружения микобактерий.
Бактериологическая диагностика туберкулеза имеет определенные преимущества по сравнению с бактериоскопическими методами. Она дает положительные результаты даже при наличии в 1мл исследуемого материала небольшого количества (20 - 100) микробных клеток, тогда как установить туберкулез микроскопическим методом удается только в тех случаях, когда в 1 мл исследуемого материала содержится нё менее 100 тыс. микобактерий (Р.0. Драбкина,1968).
B основе культивирования микобактерий лежит их способность размножаться in vitro на соответствующих питательных средах. Чтобы получить чистые культуры возбудителя туберкулёза, материал подвергают предварительной обработке. Предложено много методов патологического материала с применением кислот, щелочей и других веществ, которые гомогенизируют материал и убивают сопутствующую микробную флору. Выбор метода зависит от свежести исследуемого материала. Наиболее часто применяют общеизвестные методы А.П. Аликаевой, Гона, Левёнштейна, Сумиоши, Мазура и др.
Обработанный для исследования материал высевают в 5 - 10 пробирок с яичной средой и инкубируют в термостате при 37 °С. Для выявления начального роста, пробирки с посевами просматривают не реже одного раза в неделю. Если обнаруживается рост, то у выделенных культур изучают характер колоний, тинкториальные свойства при окраске по Цилю - Нильсену, морфологические и культурные свойства путем пересева на различные питательные среды, МПА, МПБ, культивируя их при разных температурных режимах: 20 - 22°, 37 - 38° и 45° С.
Для более раннего выявления микобактерий туберкулеза предложен метод микрокультивирования, модифицированный в 1941 г. Праисом. Данный метод в отличие от классического позволяет поставить диагноз за 5 - 10 дней (Р.В. Пожалови др., 1965; Варец, 1972).
Сравнительным изучением искусственных питательных сред, применяемых в практических лабораториях различных стран, установлено, что на жидких питательных средах (Банича, Школьниковой и картофельной среде с сывороткой) при посеве любого патологического материала рост туберкулезных микобактерий обнаруживается к 12-му дню, а на яичных, средах Гельберга и Левенштейна - Иенсена - к 30-му. B ветеринарных бактериологических лабораториях рекомендуется пользоваться пируватсодержащей средой (Н.А. Александров, 1974) или средой Гельберга, но исследуемый материал обрабатывают предварительно 5% раствором щавелевой кислоты, которая слабо влияет на микобактерии туберкулеза и
одновременно обезвреживает постороннюю микрофлору (Д.Д. Новак, 1968; В.H. Банникова, 1980).
В целях большей вероятности получения культур микобактерий, а также одновременной групповой их дифференциации высевают исследуемый материал также сразу на несколько сред: Петраньяни, МПА, МПБ, а иногда и на среду для выращивания возбудителя паратуберкулеза (Г.А. Юдин, 1968). Делая высевы на среды Петраньяни и Гельбера из органов и тканей со специфическими изменениями, можно получить рост микобактерий туберкулеза в 88,8 %, из гиперплазированных лимфоузлов - в 18,2 , а из лимфоузлов, макроскопически не измененных - в 10,9 % случаев (Л.К. Сидорова,1969), а из носового секрета животных, реагирующих на туберкулин, до 5% случаев (Konter et al., 1978).
Ha основе яичных питательных сред и углеводородов (н-алканов) Л.М. Ходун (1997) создал новую питательную среду ФАСТ-ЗЛ. При посеве суспензии биоматериала от больных туберкулезом животных по данным автора сроки роста на среде ФАСТ-ЗЛ сокращаются по сравнению со средой Гельберта в 2,7 раза с одновременным увеличением интенсивности роста бакмассы в 2,5 раза.
Для повышения эффективности бактериологического метода исследования при туберкулезе крупного рогатого скота В.Г. Кондратьев (1980) считает целесообразным создавать повышенную концентрацию углекислого газа в, емкости, где культивируются микобактерий. B таких условиях он получил положительных результатов на 15% больше. Ha основании характера роста культур на питательных средах можно ориентировочно дифференцировать туберкулезные культуры млекопитающих (человеческий и бычий виды) от других микобактерий (птичий вид, атипичные и сапрофитные). Однако окончательную видовую принадлежность выделенных микобактерий туберкулеза устанавливают на основании результатов биологического исследования.
Серологическая диагностика . Наиболее приемлемой для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота является реакция связывания комплемента. Однако мнения о диагностическом значении PCK при туберкулезе разноречивы. С.Н. Вышелесский (1913), изучая РСК с сыворотками больного туберкулезом крупного рогатого скота, получил положительные результаты в 42,9% случаев. П.П. Вишневский (1928) предложил ставить PCK по Шютцу - Шуберту. А.M. Говоров (1933) доказал более высокую чувствительность PCK с антигеном Боккэ и Негри для выявления животных, больных активной формой туберкулеза. Й.А. Каркадиновская (1956), А.H. Макковейская (1964), М.А. Журнакова и др. (1964) также пришли к выводу, что РСК представляет определенную ценность.
Т.А. Луценко (1949 - 1961) приготовил антиген из полисахаридного комплекса, полученного из микобактерий туберкулеза, и доказал высокую специфичность и чувствительность PCK с полученным антигеном. Эти
данные были подтверждены работами Г.А. Козловского (1959) и А.И. Кузина (1960), которые при положительных результатах PCK в высоких титрах обычно обнаруживали активный туберкулезный процесс.
П.А. Триленко (1961), M.A. Журнакова (1963), В.А. Колокшанский и В.А. Кузяев (1965) и другие исследователи предложили использовать реакцию длительного связывания комплемента (РДСК). По их мнению, РДСК можно применять в качестве дополнительного метода диагностики туберкулеза и особенно для выявления животных с активным туберкулезным процессом.
M.K. Исаев (1972), А.И. Кузин (1975), Б.E. Кноринг, Т.Ф. Оттен (1975) рекомендуют применять для диагностики туберкулеза реакцию гемагглютинации (РГА). Однако С.В. Кныш (1968), П.А. Нарожный (1971), сравнивая РГА с другими серологическими реакциями при туберкулезе крупного рогатого скота, установили, что она уступает реакции гемолиза (PГ) и PCK.
П.E. Савченко (1964) предложил использовать в качестве дополнительного лабораторного метода диагностики туберкулеза крупного рогатого скота реакцию диффузной преципитации (РДП).
Сравнительное изучение различных серологических методов, проведенное Bochdalek (1972), Vugi, Naraci (1972), Zimmerman (1972), Lepper (1977), показало, что эти реакции не могут заменить туберкулиновую пробу, а лишь способны служить в качестве дополнительного теста.
Учитывая нестрогую специфичность серологических реакций, не рекомендуется применять их в благополучных хозяйствах, так как они по чувствительности все же уступают туберкулиновым пробам (В.И. Ротов и соавт., 1979). PCK рекомендуется использовать как дополнительный способ при отборе для диагностического убоя животных, положительно реагирующих на туберкулин. Основным методом для массовой диагностики, туберкулеза остается аллергический с помощью туберкулина.
В проблеме диагностики туберкулеза, как в медицине, так и в ветеринарии, одним из основных вопросов является индикация микобактерий в биологическом материале (М.А. Владимирский, 2003). При этом для обнаружения микобактерий, наиболее перспективным и эффективным считают применение молекулярно-генетических экспресс методов диагностики, в частности полимеразной цепной реакции – ПЦР (А.Н. Шарав с соавт., 2003). Впервые в нашей стране молекулярное клонирование ДНК M. bovis (штамм БЦЖ) проведено Я.А. Бертюк в 1988 году, на основе чего в дальнейшем разработана реакция ДНК – ДНК гибритизации, предложенная для дифференциации M. bovis от атипичных микобактерий (Я.А. Бертюк, 1989). В 1983 году Керри Мюллее разработал метод ПЦР, позволяющий за несколько часов получить миллионы копий выбранного фрагмента ДНК в реакционной смеси (А.Н. Шарав с соавт., 2002). В основе метода ПЦР лежит многократная амплификация (копирование) видоспецифического фрагмента ДНК микроорганизмов с помощью фермента ДНК-полимеразы, являющегося
