маркером для данного вида возбудителя, что дает возможность получить положительный результат при наличии в исследованном материале единичных клеток возбудителя.
В ПЦР – диагностике туберкулеза, при индикации бактерий в патологическом материале, используют различные праймеры. Однако единого мнения о диагностической значимости и возможности применения этих тест систем в диагностике туберкулеза нет в связи с получением ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому метод ПЦР пока не нашел широкого применения в лабораторной ветеринарной практике (М.С. Колмыкова, 2007).
Тем не менее, уже накоплен определенный опыт практического применения ПЦР для диагоностики туберкулеза крупного рогатого скота и контроля благополучия хозяйства в различных регионах России (А.Н. Шаров, 2000, В.А. Душкин и соавт., 2004). В настоящее время в ветеринарных лабораториях РФ испытывается ПЦР тест-системы четырех отечественных производителей: ГУН ЦНИИ Эпидемиологии и Роспотребнадзора, ЗАО «ЛАГИС», ООО «Компания Биоком» и одна тест-система для дифференциации M. bovis и M. tuberculosis производства «Нарвак» (Н.А. Донченко, 2008). Сравнительное испытание указанных тестов показало, что при имеющихся преимуществах и недостатках, все они достаточно чувствительны и специфичны в диагностике туберкулеза (Т.А. Борисова с соавт. 2004; Р.А. Хамзин, 2006).
Иммуноферментный метод (ИФА) разработан для диагностики туберкулеза как по обнаружению антигена, так и по титру специфических антител в сыворотке крови. Метод является высокочувствительным и полученные, данные являются ценным дополнением к другим методам исследований.
Биологическая проба считается особенно ценным для выявления туберкулезной инфекции и основным для типизации бактериальных культур, а также для определения их вирулентности. Для биопробы обычно используют морских свинок, кроликов, кур, хотя можно брать животных и других видов. Этот метод дает положительные результаты у морских свинок даже при наличии в инъецируемом материале 5 - 6 микобактерий туберкулеза.
Морских свинок используют для биопробы в отношении микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов, а кроликов - для дифференциации этих двух видов. При подозрений на заражение туберкулезом микобактериями птичьего вида для опыта обычно берут кур.
Биологическую пробу применяют для исследования материала, взятого от животных при жизни, а также для получения более достоверных результатов при исследовании реагировавших на туберкулин животных благополучных хозяйств, особенно в тех случаях, когда отсутствуют клинические признаки и патологоанатомические изменения.
После заражения лабораторных животных рекомендуется через каждые 10 дней проверять увеличение паховых лимфоузлов на той стороне, где вводили исследуемый материал. Если лимфоузлы прощупываются в конце шестой недели, то животных убивают, если нет, то рекомендуется выждать еще 2-3 месяца, а затем произвести убой (табл. 4). При неясных результатах исследования повторно заражают 3 - 5 морских свинок, наблюдают за ними 3 месяца.
Таблица 4. Определение вида микобактерий тубёркулеза при заражении лабораторных животных (доза1мг).
| Вид животного | Способ заражения | Вид микобактерий | ||
|---|---|---|---|---|
| бычий | человечий | птичий | ||
| Кролики | внутривенно | Гибель через 17-50 дней при генерализованной форме туберкулеза | Наличие очагов туберкулеза в печени | Гибель через 10- 15 дней от сепсиса |
| Морские свинки | подкожно | Генерализованная форма туберкулеза через 60-90 дней | Генерализованная форма туберкулеза через 60-90 дней | - |
| Куры | внутримышечно | - | - | Генерализованная форма туберкулеза через 60-90 дней |
Для выделения возбудителя туберкулеза при латентной форме рекомендуется выдерживать подопытных животных до 6 месяцев (А.И. Кузин, 1980).
Сопоставляя биологический метод с другими, И. Дайглер (1952) установил, что биопроба подтверждает туберкулез во всех 100% случаев. B целом биологической пробой удается выделить возбудителя в 2 раза чаще, чем методом посева (Кoster zenski и др., 1978). Однако широко применяемые химиотерапевтические средства и антибиотики снизили вирулентность одних штаммов возбудителя туберкулеза по отношению к морской свинке, а других даже сделали авирулентными. Поэтому проблема совершенствования биологического метода диагностики туберкулеза, особенно для выявления микобактерий с ослабленной вирулентностью остается нерешенной.
Предпринимаются попытки искусственно повысить чувствительность лабораторных животных к ослабленным штаммам микобактерий. Установлено, что можно усилить туберкулезный процесс у этих животных путем введения им иммунодепрессантов и лекарств, понижающих резистентность организма. Так, с этой целью можно кроликам внутривенно инъецировать 5%-ный аллоксан на физрастворе в дозе 120 мг на 1 кг массы, морским свинкам – внутримышечно адренокортикотропный гормон (AKTF)
в течение недели по 30 единиц. Кролики, получившие аллоксан и зараженные микобактериями, уже через месяц значительно истощались, на вскрытии у них обнаруживалось злокачественное течение туберкулеза; у контрольных животных такие изменения были обнаружены лишь через З мес. У морских свинок, которым вводили АКТГ, множественные туберкулезные изменения обнаружены через 3 недели после заражения, а у контрольных - к этому сроку отмечены лишь единичные туберкулезные узелки в печени (М.А. Сафин и соавт., 1971).
Идеального метода диагностики туберкулеза пока нет. Blancau (1972), сравнив различные методы диагностики, установил, что у туберкулезного крупного рогатого скота реакция преципитации давала 40% положительных результатов, реакция диффузии в агаровом геле - 37, реакция пассивной гемагглютинации - 34, внутривенная проба - 48, подкожная проба - 94, внутрикожная проба - 96%. Эти же методы у здорового крупного рогатого скота давали ложные реакции соответственно в 10, 8, 12, 4, 10, 16% случаев. Поэтому первичный диагноз на туберкулез по туберкулиновой пробе обязательно должен быть подтвержден послеубойным патологоанатомическим осмотром лимфоузлов и внутренних органов, а также лабораторными исследованиями.
Неспецифические реакции на туберкулин.
Не умаляя значения общепризнанных положительных качеств аллергической диагностики туберкулеза, многие исследователи указывают на непостоянство и другие недостатки этого метода и отмечают необходимость его дальнейшего совершенствования.
Одним из существенных недостатков аллергической диагностики туберкулеза является появление у здоровых животных неспецифических реакций на туберкулин, обусловленных причинами самого разнообразного характера. Убой таких животных обычно не приводил к прекращению выделения реагирующих из остального поголовья. Такое явление, имеющее довольно широкое распространение, стало серьезной проблемой.
Bo Франции животные с неспецифическими реакциями составляли в 1964 г. - 16,4, а в 1971 г.- 30%; в CШA в 1945 г. -10; а в 1961 г.- 50% от числа реагировавших животных (Lucas, 1972). B отдельных странах даже благополучных по туберкулезу крупного рогатого скота, до 75% животных дают неспецифические реакции на туберкулин (Nassol, 1965; Schlisser, 1969; Ionoviec, 1972).
Неспецифические реакции на туберкулин регистрируются и в хозяйствах PT. Так в 1995г. в 506 хозяйствах, благополучных по туберкулезу было выявлено 5809, в 1996 году в 687 хозяйствах 10448, а за 10 месяцев 1997 года в 698 хозяйствах 6234 крупного рогатого скота, реагирующего на туберкулин, большинство из которых сданы на убой. При послеубойном осмотре туш и внутренних органов изменений, характерных для туберкулеза
