в большей степени характеризуются повреждением ИЕ atteagtanea клетки, в первую очередь цитоплазматической ee ТЕНИ взаимодействием с нуклеиновыми ИЗ И GREAT экструдированных кормов с дополнительным вн выявило ряд наиболее токсичных, первое место heresи Икоторых занимаетnocoGOR двухвалентное железо, к тому же, нЕт ей, обработки также повьшшает степень токсичности субстр бактериальным клеткам. 17.3 Изучение влияния кормового фактора на состав рубцовой жидкости, влекущее изменение межклеточного взаимодействия микрофлоры рубна по изменению интенсивности свечения биохемилюминесцентных микроорганизмов. и При проведении исследований использован рекомбинантный штамм Есой K12 TG] с клонированными 1ихСРАВЕ генами Photobacterium leiognathi 54D10, выпускаемый в виде лиофилизированного препарата под коммерческим — «Эколюм» (HBO «Иммунотех», Москва). Непосредственно перед проведением исследований его восстанавливали из лиофилизированного состояния добавлением 10 мл охлажденной дистиллированной воды, выдерживали при 2-4 °C в течение 30 минут, после чего доводили температуру бактериальной суспензии до 25 °С. р В качестве других микробных сенсоров выступала серия репортерных микроорганизмов с индуцируемой экспрессией /их-генов, клонированных под различными промоторами (табл. 59), любезно предоставленных Мануховым ИВ.(ГосНИИгенетика,Россия). В результате подобной генетической организации, использованны A репортерные конструкции, характеризовались исходно низким уровнем свечения, но относительно специфично отвечали его индукцией при воздействии соответствующего повреждающего фактора.
| Таблица 59 их-генами | — Особенности промоторов | репортерных штаммов, сшитых с |
|---|---|---|
| дегидраза. | ||
| | за 50х5 | | активные Gees pengamona формы кислорода mera 2 | | Oommen отр |
| Ги | Окислительный стресс | |
| 6 ВЕСА. активатор $ОЗ-ответа | Повреждение ДНК | |
| Поврежде ттт |
Перед проведением эксперимента названные штаммы выращивали в течение 18-24 часов na LB-arape в присутствии 100 мкг/мл ампициллина - селективного фактора гибридных плазмид, после чего полученную биомассу переносили в свежий ГВ-бульон и дополнительно подращивали до ранней экспоненциальнойОбъектами исследованияфазы (01540=явилась0,35 ед.).рубцовая жидкость мясного крупного рогатого скота казахской белоголовой породы, использованная в экспериментах в нативном состоянии после грубой фильтрации, либо после центрифугирования при 1000 g в течение 15 минут с использованием центрифуги СМ-6М (Элми, Россия). Последовательные двукратные разведения осуществляли физиологическим раствором в 96-луночном планшете до титра 1:1024. Реакционную смесь формировали в непрозрачных лунках планшета, при этом вносили 100 мкл бактериальных биосенсоров и 100 мкл испытуемой рубцовой жидкости, после чего планшет помещали в измерительный отсек люминометра LM-01T (Immunotech, Чехия) и проводили измерение в кинетическом режиме с использованием программы «Kilia» в течение 60 минут в случае с сенсорным штаммом и 120 минут при использовании репортерного штамма. Полученные экспериментальные данные были обработаны с использованиемНа пакета офисных программ Microsoft. жидкости первомс использованиемэтапе было оцененосенсорныхобщее токсическоебактериальныхдействиештаммоврубцовойс конститутивным свечением. Данный эффект выявляется по уровню тушения люминесценции в опытном образце по сравнению с контрольными пробами и основан на прямой связи данного явления с общим метаболизмом клетки и ее жизнеспособности. При контакте нативной рубцовой жидкости с сенсорными люминесцирующими бактериями E.coli было зарегистрировано дозозависимое ингибирование свечения в первые секунды контакта. При этом ко второй минуте контакта тушение составило до 5,20 + 0,59 % в случае с исходной средой и убывало в ряду двухкратных разведений до 102,56 + 4,83 % при титре 1:1024 (рис.1). С одной стороны это может быть спровоцировано агрессивными компонентами, входящими в состав рубцовой жидкости, что ведет к нарушению целостности мембран и гибели клеток. С другой стороны, данное явление может быть вызвано сменой напряженности протонного потенциала ввиду попадания клеток в среду с более низкими значениями кислотности. Возможным следствием подобного эффекта является поглощение фотонов компонентами рубцовой жидкости. ввиду ее мутности и окрашенности, что воспринимается как токсическое воздействие отдельных компонентов, так как при дальнейшем изучении кинетики свечения бактериальных клеток наблюдается усиление свечения, превышающее таковое в контрольных пробах. Так, после 30 минут инкубации смеси уровень свечения в пробе с нативной рубцовой жидкостью достигает контрольного и с течением времени повышается до 190,59 + 22,15 % после 60 минут контакта. При этом разведение
исходной изучаемой жидкости позволяло зарегистрировать еще большую стимуляцию люминесценции биосенсоров, при титре Е достигающую пиковых значений и составляющую 1223,52 + 119,58 % от контрольных. Дальнейшее разведение вплоть до 1:1024 не дает дополнительной стимуляции свечения, параллельно не оказывая ингибирующее воздействие в первые минуты контакта. С другой стороны, проведение дополнительной процедуры центрифугирования рубцовой жидкости при 10008 в течение 15 минут с целью осаждения взвешенных частиц не привело к значимым изменениям получаемых результатов и позволяет рекомендовать проводить оценку данной биологической жидкости в исходном нативном состоянии.
Полученные данные по оценке общей токсичности характеризуют рубцовую жидкость как достаточно благоприятную среду для роста бактерий, несмотря на первоначальное дезинтеграционное воздействие на бактериальные клетки. Это обеспечивается обилием питательных субстратов различного уровня ферментации в данной среде, включая даже такой легкодоступный метаболит как глюкоза.
Дальнейшие исследования были направлены на выявление характера воздействия рубцовой жидкости на бактериальные клетки и выяснения особенностей ответа клеток. В таком случае, если в среде присутствует фактор активации специфического промотора, интегрированного непосредственно перед [ихСРАВЕ генами, начинается экспрессия последних, что отражается увеличениеммеханизмов воздействиясвечения. В нативнойнашей ‚работерубцовойбыло жидкостиосуществленона бактериальныеисследование клетки, при этом проведена серия экспериментов с использованием репортерных штаммов бактерий, у которых стресс море клонированы перед генами свечения, Применение штамма E.coli SabA::lux, р р использованный промотор отвечает за синтез ие (6) дегидразы, представляющего собой ключевой фермент реакций ИОСИНТЕЗА жирных кислот мембраны, а также штамма E.coli ibpA::lux, в которой специфический промотор отвечает за синтез шаперона теплового Ro связывающего белки и облегчающего их последующий рефолдинг в зависимыми шаперонами , не позволило зарегистрировать каких либо значительных эффектов (рис.27).
