бактериальных биосенсоров, показанное ранее на примере лиофилизированной культуры рекомбинантных штаммов E.coli К12 TG1 препарата «Эколюм» (Logachev её al., 2015). Однако в настоящей работе нами был использован культивируемый штамм, характеризующийся иным уровнем восприятия внешних факторов (Deryabin et al., 2016), в связи с чем на первом этале была изучена кинетика свечения бактерий в присутствии рубцовой жидкости. Среди использованных штаммов только E.coli pAL103 и E.coli pALl04 характеризуются фоновым уровнем свечения, достаточным для аппаратной детекции его кинетики, составляющим 252 + 4 и 12440 + 218 RLU (рис.29).
an — — 100000 100000 3 eas в} | filed Е | ] р £10004 4 и В ы - i: | 100 й a 100 4| | |ВВ.й 9 | "аeseel) ве e | : hb| |8| 9aSВ , PALION РАЁЮ? pALI03. pALI04 pALIOS— рА110б Рис. 29: Диаграммы начального уровня свечения (серые столбцы), ‚ ссреднего уровня свеченияс (черные столбцы) и суммарного накопления свечения за 120 минут экспозиции (белые столбцы) использованных штаммов ЦШаммы E.coli pAL105 и E.coli pAL106, несмотря на достаточный уровень люминесценции,начального свечения,в резульс т атеч е ниемчего временисуммарныйтеряютквантсп о собностьвый выходк характеризуются гораздо меньшими значениями, чем у выше указанных рекомбинантных штаммов бактерий. Нативная рубцовая жидкость демонстрировала выраженное ингибирующее воздействие до 49 % для штамма E.coli pAL103 и 43 % для штамма E.coli pAL104 от контрольных с начала момента контакта. Однако последующая инкубация He вела к качественным изменениям параметров биолюминесценции, ак 60 минуте было зарегистрировано восстановление до 59% и 53% (рис.30). Подобная реакция связана как с особенностями окраски рубцовой жидкости, обуславливающей поглощение квантов света и, как следствие, снижение общей интенсивности люминесценции, так и острой
токсичностью, выраженной значительной ионной силой тестируемых образцов, что ведет к дестабилизации метаболических процессов бактериальной клетки и утрате в первые секунды контакта.
Разведение рубцовой жидкости ожидаемо вело к снижению описанного выше явления, причем при ее концентрации 25% и ниже эффекты тушения свечения меняются в диаметрально противоположном направлении — на первых минутах уровень свечения выше, чем на последней минуте контакта.
‘same
_
tex
90%
#
Е 80%
а
70%
oO
50%
40% 7 55 x a
5 2 8
Концентрация рубцовой жидкости, %
—+— РАЁ103Ha O минуте ~—O— pAL103на 60 минуте
—\— pAL104на 0 минуте —&— pAL104на 60 минуте
Рисунок 30: Зависимость биолюминесцентного индекса штаммов E.coli pAL103 и E.coli
Пороговой концентрацией используемой биологической жидкости, которая не проявляла значительного влияния на свечения используемых бактериальных биосенсоров, определяемое уровнем ЕС (сохранение 80% свечения от контрольных показателей) оказалась 12,5%. Таким образом, данная . концентрация рубцовой жидкости была использована в качестве ингибитора активности ацильных производных гомосеринлактона с целью исключения собственного эффекта подавления свечения, На втором этапе нами была исследована способность рубцовой жидкости осуществлять инактивацию молекул АГЛ, что регистрируется снижением интенсивности люминесцентного отклика по сравнению с пробами,
содержащими только аутоиндуктор в соответствующей концентрации. Оказалось, что эффективность воздействия на ГСЛ < различной длиной ацильного хвоста неодинакова, однако обусловлена не специфичностью воздействия, а по всей видимости, характером реакции биосенсора. Нами были сформированы три группы биосенсоров для оценки активности различных АГЛ, в каждой из которых был штамм, имеющий гены рецепторного белка и соответствующий ему штамм с делецией указанного гена. Реакция штамма Есой pAL101 на С4-ГСЛ развивалась при концентрации 10° Ми выше, причем пиковый уровень люминесценции был зарегистрирован при 10* М и составлял 7030 RLU (рис. 31). В то же время, в ответ на пробу с указанным АГЛ и рубцовой жидкостью данный биосенсор реагировал в целом ниже. Наибольшая ингибирующая способность наблюдалась при минимальной детектируемой концентрации (10% M) и составляет 79%, а с увеличением содержания аутоиндуктора ожидаемо эффективность инактивации снижается вплоть до 19,5% при 104 М, где свечение биосенсора составило 5656 RLU (таблица 2). Делетированный по RhIR штамм E.coli pAL102 не реагировал на С4-ГСЛ и уровень его свечения достоверно не изменялся при воздействии пробы с этим аутоиндуктором и рубцовой жидкостью.
10000 0000000 1000
1000000
10000
2 = а 100 _ 4
$100 /
q 1000
5 о eye
10 к.
®
1 1 1
0 608 607 £06 E05 604 0 608 £07 £06 605 E04 © 608 E07 B06 505 E04
‘С4-Гсл, м ‘оксо-С6-ГСЛ, М 012-70, М
Рисунок 31: Зависимость свечения штаммов от концентрации АГЛ в пробах без рубцовой жидкости (W) и в пробах содержащих рубцовую жидкость (RF).
Несколько иная картина наблюдалась в отношении оксо-С6-ГСЛ, для которого в качестве споцифичного биосенсора был выбран штамм E.coli pAL103. Данные бактериальные клетки воспринимали оксо-Сб-ГСЛ с НИЗКОЙ ИСПОЛЬЗОВАНО eo ae AP Sa asae порогом насыщения при 10° М, выше которой не происходило изменение свечения, сохранявшееся на уровне 1008720-3806 RLU. Таким образом, было достигнуто избыточное количество аутоиндуктора, который обеспечивал
