активацию свечения во всех клетках культуры. Рубцовая Жидкость продемонстрировала выраженную инактивирующую способность в отношении оксо-Сб-ГСЛ, максимальное значение которой было достигнуто при 10* Ми составляла 95%, а при концентрациях 107 М и 108 М равна 82% и 32%, соответственно. Воздействие образцов с высокой концентрацией оксо-С6-ГСЛ (от 10° до 104 М), подвергнутых обработке рубцовой жидкостью, на штамм E.coli pAL103 вела к формированию люминесцентного отлика, сопоставимого со свечением проб (Р>0,05), содержащих только аутоиндуктор (986400+17706 RLU). Это свидетельствует о том, что даже после контакта с рубцовой жидкостью в системе оставалось достаточное количество оксо-С6-ГСЛ, способного индуцировать рекомбинантный люминесцирующий штамм. Штамм E.coli pAL104, не способный синтезировать белок LuxR, в присутствии этого же аутоиндуктора не изменял уровня своего свечения во всем диапазоне концентраций и средний уровень люминесценции составил 21648=376 RLU. Пробы, содержащие различные дозы оксо-Сб-ГСЛ совместно с рубцовой жидкостью также характеризовались стабильным неотличимым от контрольного уровня свечением (19961+722 RLU). Это свидетельствует об исключении какого либо влияния как самих аутоидукторов, так и рубцовой жидкости непосредственно на гены люминесценции (/uxCDABE) и эффектовсвидетельствуетингибированияо кворумсвечения.зависимой принадлежности рассматриваемых
Таблица 61- Доля ингибирования свечения рекомбинантных штаммов при контакте с рубцовой жидкостью (ВЕ) и ГСЛ по отношению к пробам только с ГСЛ.
| Probe type | 103 | AHL 107 | concentration, 105 | 105 М | 104 |
| ee | - | - | 7% | 2% | 20% |
| ПОPALIOS+OK0-CS | 95% | 82% | 30% | 5% | 1% |
| E.coli pALI05+C12- HSL+RF | й | й | 27% | 16% | 21% |
Наконец, использованный в нашей работе АГЛ с наибольшей длиной алкильного хвоста, содержащего двенадцать атомов в углеродной цепи, регистрировался с использованием штамма £.coli pAL105. Данный биосенсор позволял детектировать С12-ГСЛ начиная с концентрации 105 М с последующим дозозависимым ростом индукции. Однако уровень люминесцентного отклика данного биосенсора характеризовался низкими значениями свечения (при 10* М С12-ГСЛ равный 170 RLU), что вело к менее значимым изменениям люминесценции. Так, пробы, содержащие рубцовую жидкость и 10° М С12-ГСЛ, характеризовались свечением, на 27% ниже, чем пробы с таким же содержанием аутоиндуктора без рубцовой жидкости.
15
Увеличение концентрации АГЛ ожидаемо вело к уменьшению способности рубцовой жидкости ингибировать его активность, что отразилось в инактивирующей эффективности в 16% и 21% при 10° и 10“ М С12-ГСЛ, соответственно. Как и в выше описанных случаях, делетированный по гену, ответственным за синтез рецепторного белка (в данном случае LasR) штамм E.coli pAL106 также не реагировал изменением свечения ни на один из используемых аналитов и в опытных пробах уровень люминесценции был неотличим от такового в контрольных пробах.
Таким образом, была обнаружена способность рубцовой жидкости осуществлять инактивацию АГЛ, что результируется в снижении интенсивности реакции использованных бактериальных биосенсоров. Причем ингибирование по всей видимости не связано с длиной алкильного хвоста в молекуле ГСЛ, а полученные различия обусловлены неодинаковой чувствительностью использованных в работе биосенсоров. Тем не менее, развитие данного подхода позволит осуществлять регулирование активности нежелательной микрофлоры путем избирательного или тотального подавления их коммуникационных сигналов,а также позволяетс другой стороны взглянуть на характер взаимоотношений в паре микроорганизм— макроорганизм.
Данное исследование выполнено при поддержке гранта Российского научного фонда (проект№ 16-16-10048).
Список использованных источников
Abdl-Rahman, М. А., Sawiress,в Е. A., and Abd El-Aty, A. M., "Effect of sodium lauryl sulfate-fumaric Acid coupled addition on the in vitro ramen fermentation with special regard to methanogenesis," Vet.Med.Int., Vol. 2010, 2010, pp. 858474. 2. Abou Akkada, A. R. Some observation on the nitrogen metabolism of rumen proteolitic bacteria/ А. В. Abou Akkada, Т. H. Blackburn // J. Gen. Microbial. 1963. - V.31,N 3. -Р. 461-469. 3. Aguiar, В. and Wink, M., "Do naive ruminants degrade alkaloids in the rumen?,” J.Chem.Ecol., Vol. 31, No. 4, 2005, pp. 761-787. 4. Alves, 5. P., Maia, М. R., Bessa, В. J., Fonseca, A. J., and Cabrita, A. R., "Identification of C18 intermediates formed during stearidonic Acid biohydrogenation by rumen microorganisms in vitro," Lipids, Vol. 47, No. 2, 2012, pp. 171-183. 5. Amin, М. К. and Onodera, R., "Effects of salinomycin and vitamin B(6) on in vitro metabolism of phenylalanine and its related compounds by ruminal bacteria, protozoa and their mixture," J.Gen.Appl.Microbiol., Vol. 44, No. 1, 1998, рр. 1-9. 6. Annison, Е. Е. Portal blood analysis in the study of the absorption of ruminal fermentation produces / В. Е. Annison, К. J. НИ, О. Lewis // Biochem. J. — 1955. - У. ТОК 7. Annison, Е. Е. Ruminal ammonia formation in relation with varions diets / Е. Е. Annison, М. J. Chalmers, $. В. Marschall, В. L. Synge // J. Agr. Ski. — 1954. - У. 44. -Р. 270-273. . 8. Annison, Е. F. Studies on the portal blood of sheep. Absorption of volatile fatty acids from the rumen ofthe sheep / Е. Е. Annison, К. J. Hill, О. Lewis // Biochem. J. - 1957. - У. 66, N 4. -Р. 592-599. 9. Baar, С. Eppinger,M., Raddatz, G., Simon, J., Lanz, С, Klimmek, О. Nandakumar, R., Gross, R., Rosinus, A., Keller, H., Jagtap, P., Linke, B., Meyer, F., Lederer, H. & Schuster, S.C. 2003. Complete genome sequence and analysis of Wolinella succinogenes. Р. Natl. Acad. Sci. United States of America 100: 11690— 11695. 10. Bach, A., Calsamiglia, S., and Stern, M. D., "Nitrogen metabolism in the rumen," SHBG Sth WAAL EE: Sep 2005. ЕЕ 11. Bal, M. A. Stage of maturity, processing, and hybrid effects on ruminal in situ rnnim.erFeed Sci. GiandкеTechnology. мон—и2000. — У. ее86, М 1-2.в-Р.a83-94, BAG tShinners/
Bauman, D.E., Lock, A.L., Corl, B.A., Ip, C., Salter, А.М. & Parodi, P.M. 2005. Milk fatty acids and human health: potential role of conjugated linoleic acid and trans fatty acids. In: Serjrsen К. Hvelplund Т. and Nielsen М.О. (Eds.), Ruminant Physiology: Digestion, Metabolism and Impact of Nutrition on Gene Expression, ImmunologyAcademic Publishers.and Stress, pp. 529-561. Wageningen, The Netherlands: Wageningen
Bayer, В.А. & White, В.А. 2012. Phage-bacteria relationships and CRISPR elements revealed by a metagenomic survey of the rumen microbiome. Environ. Microbiol. 14: 207-227. 152
