способствовало внедрению биосенсоров. Примером может служить биосенсор для определения глюкозы в крови людей больных сахарным диабетом. Общественный интерес к медицинскому использованию биосенсоров возрос при осознании опасности загрязнения окружающей среды Beloqui, A., et al., 2006; Devillard, E., et al., 2007).
Индустриализация и новые технологии сделали жизнь человека комфортной, но создали многочисленные экологические проблемы (Guo, Y.Q., et al., 2008; Han, S. K., et al., 2002; Krause, D.O., et al., 2005; Nugent, А.Р., 2004). Действительно, пестициды, тяжелые металлы, отходы химической, фармакологической, пищевой, нефтяной, космической промьшиленности, в значительных количествах попадают в объекты окружающей среды, почву и водные источники, включаются в пищевые цепи, создавая угрозы для здоровья и жизни человека и животных. Действие ряда экотоксикантов связано с генотоксическими повреждениями генома, с возникновением и сохранением мутаций, возможно,с возникновением рака (Cottle, D.J., et al., 2011; Morgavi, D. Р., et al., 2000). Определенную роль в возникновении рака могут играть эпигенетические причины, связанные с дерепрессией или репрессией генов, модификацией оснований ДНК в области промоторов и включением «молчащих» генов в транскрипцию. В настоящее время биосенсорная техника бурно развивается и использует как традиционные, так и развивающиеся направления (наночастицы, поверхностный плазмонный резонанс, волоконно-оптические, кондуктометрические, электрохимические, генно-инженерные методы) для совершенствования химического и биохимического анализа объектов ° окружающей среды (Chung, K.T., et al., 1998; FAO, 2006, Handelsman, J., 2004; Hess,M., 2011). Совершенно очевидно, что ответ об опасности’ экотоксикантов для организма могут дать только биологические методы (Lillis, L., et al., 2001; Morgavi, D. Р., et al., 2001). Поэтому в последние годы целью многих исследований была разработка простых и адекватных методов для оценки токсического воздействия химических и физических факторов окружающей среды на организм. Так, в последние годы, наряду с биосенсорами электродных типов, широкое распространение получили цельноклеточные (whole-cell) биосенсоры (Krause, D.O., et al., 2003; Lee, М. R., et al., 2007; McSweeney, С. S., et al., 2009; Гительзон, И.И., 1984; Данилов B.C., и др., 2002; Кожебеков К. B., Голикова А. Н. 1991). Они представляют собой живые клетки (микроорганизмов или высших организмов) и дают измеряемый продукт своей геномной деятельности в ответ на присутствие токсикантов. Среди биосенсоров данного типа, микробные цельноклеточные биосенсоры — имеют многочисленные преимущества в экологическом тестировании (Dohnal, V., et al., 2008; Hook, $. Е., et al., 2012). Культивирование микроорганизмов дешевле по сравнению с культурами клеток высших организмов. Они могут быть получены в больших количествах, подвергнуты более строгому контролю, чем клетки высших организмов, и легко хранятся (Mojska, Н., 2003). При этом,
цельноклеточные биосенсоры обычно трансформированы рекомбинантными плазмидами и они имеют в составе этих плазмид промотор, отвечающий на воздействие экотоксикантом транскрипцией репортерного гена, находящегося под контролем этого промотора, и дают в результате трансляции репортерный белок, который легко измерить с помощью флуориметра, люминометра или цветной реакции (Hu, Z. H. and Yu, Н. О., et al., 2006; Ни, Z. Н., et al., 2008; Huang, Н., et al., 2010; Ishino, Y., et al., 1998; Kim, М., et al., 2011; Mobashar, M., et al., 2010; Попов B.B., Рыбина E.T., 1983). Оказалось, что цельноклеточные биосенсоры быстро отвечают на наличие в среде экотоксикантов и в этом качестве превосходят физико-химические методы анализа (Findley, S.D., et al., 2011; IPCC, 2007; Lean, I.J., et al., 2011; Pukall, R., et al., 2009; Чумакова, Р.И. и др., 1975). Цельноклеточные биосенсоры могут успешно применяться для научных целей: при оценке изучения генетической экспрессии, при физиологических исследованиях на животных, растениях и человеке. Преимущества использования цельноклеточных биосенсоров связаны с их высокой специфичностью, селективностью и экспрессностью. Новые возможности использования цельноклеточных биосенсоров связаны также с возможностью изучать процессы в клетке, которые были ранее недоступны для анализа (Brulc, J.M., et al., 2009; Handelsman, J.. 2004). Принципиальной особенностью использования цельноклеточных биосенсоров является способность с их помошью оценить, не только биодоступность аналита, но и физиологическое значение получаемых данных. Генетически измененные цельноклеточные биосенсоры реагируют на наличие аналита путем индукции гена, связанного с чувствительным к аналиту промотором путем создания гибридного (фьюз) гена (Davis, C.K., et al., 2012; Griffith, G.W., et al., 2010; Janssen, P.H., Киз, М. 2008; Kingston-Smith, А.Н., et al., 2005). Обычно такие гибридные гены существуют в генетически трансформированных бактериальных клетках в составе плазмид, которыми трансформируют клетки (Frutos, P., et al., 2008; Li, К. Et al., 2012). Структурная часть генетической конструкции кодирует измеряемый аналитическим способом репортерный белок. Сливаемый со структурным геном промотор обычно представляет собой регуляторныйБиодоступныйкомпонент, селективныйи индуцируемый аналитом. взаимодействует с промотороманалит проходитгена-репортерачерезнепосредственномембрану клеткиили путеми инактивации его репрессора. Индуцированный ген транскрибируется (Blank, R., et al., 2003; Krause, D.O., et al., 2001; Lema, M.,et al., 2001; Qi, M.,et al., 2011). Трансляция мРНК репортерного гена приводит к синтезу белка, который легко регистрируется. Транскрипционные конструкции, созданные путем слияния (fuse, фьюза) гена — репортера и промотора являются мощным орудием для изучения экспрессии бактериальных генов в природной среде обитания и для детекции определенных соединений в окружающей среде (Kaiser K.L., Esterby S.R., 1991; Liggenstoffer, A.S., et al., 2010; Rattray, RM. & Craig, А.М. 2007). Хотя транскрипционные конструкции, созданные для этой цели, часто оказываются достаточно слабо экспрессируемыми, и их индукция может
происходить в течение длительного времени и экотоксикант может поступить к биосенсору в ограниченный промежуток времени, необходимость определять экспрессию генарепортера, существует. Действительно, определение экотоксиканта может быть принципиально важно для понимания экологической обстановки в данном регионе (Kingston-Smith, А. Н., et al., 2003; Mackie, R.L., et al., 2007; McQuigge, M., et al., 2000). Для того, чтобы синтез репортерного белка произошел, необходимо создать генно-инженерными методами плазмиду с клонированным в нее “теном-репортером” под управление промотора, который отвечает на исслелуемый аналит (Bayer, Е.А. & White, B.A. 2012; Devillard, E., et al., 2006; Fries, С. F., et al., 2002), Несколько условий необходимо, чтобы использовать такую биосенсорную конструкцию. Во-первых, генетическая конструкция, отвечающая за синтез репортерного белка, должна быть относительно простой, во-вторых, специфичность чувствительного элемента (промотора) по отношению к аналиту - высокой, и, наконец, в клетке должны отсутствовать сходные протеины или субстраты, которые могут помешать определению данного репортерного белка (McSweeney, C.S. & Makkar, Р.5. 2005; Quirk, MF., et al., 1988). Обычно промоторы и энхансеры располагают в с15- положении по отношению к структурному целевому гену. Исследования на клеточных культурах и трансгенных животных позволили отобрать репортерные гены и транскрипционные элементы, ответственные 3a тканево-специфическую экспрессию генов, в частности тех, которые могут участвовать в ответе на заболевания (Dehority, В.А. 2003; Duffy, G.. 2003). Было показано, что воздействие на некоторые гены необходимо для лечения наследственных, вирусных, бактериальных, восталительных, сердечно - сосудистых и раковых заболеваний. Была оценена также роль генов межклеточной коммуникации и их влияние на активность ряда генов у микроорганизмов (Bayer, S., et al., 2010; Davis, C.K., et al., 2011; Rubanza, C.D.K., et al., 2005). Научные исследования позволили изучить с15-действующие структуры генома(энхансеры, промоторы). Работы на клеточных культурах и трансгенных животных и растениях позволило отобрать репортерные гены, ответственные за базальный и тканевоспецифический уровень синтеза белков клетки. Идентификация некоторых белка),репортерныхкоторыегеновмогут(люциферазыиспользоватьсясветляковкак неинвазивныеи зеленогомаркерыфлуорсцирующегогенетической экспрессии, позволяет в режиме реального времени (например, с помощью конфокальной ‘спектороскопии) следить за экспрессией репортерных и регулирующих метаболизм клетки белков Belkin S., 2003; Benson, A.K., et al., 2010; Pariza, M.W. 2004; Scharrer, Е. and Grenacher, B., 2002; Schoefer, L., et al., 2002; Shedova, Е. N., et al., 2009; Shin, E.C., et al., 2004; Shin, Н. $., et al., 2001). Так, можно оценить влияние различных транскрипционных факторов и медиаторных механизмов клетки для лечения ряда заболеваний, включая рак, вирусные, воспалительные инфекции, сердечно-сосудистые заболевания Belanche, A. Et al., 2012; Dodd, D.,et al., 2011).
