Для изучения активности рубцовой жидкости использовали люминесцирующий штамм «Эколюм», который восстанавливали из лиофилизированного состояния путем добавления 10 мл дистиллированной воды, после чего выдерживали флакон в течение 30 минут при 4 °С. В лунках планшета были серийно разведены физиологическим раствором инкубированные образцы. Объем жидкости в каждой лунке составил 100 мкл. Во все лунки внесено по 100 мкл восстановленного «Эколюма», таким образом, соотношение анализируемого субстрата и биосенсора составило 1:1. Свечение измеряли 60 минуг на пюминометре. Уровень биолюминесценции бактериальных штаммов выражали в единицах биолюминесцентного индекса (БЛИ), рассчитанного по формуле:= yon, ен oe ome где !>””=. — уровень люминесценции опытной> пробы Ha п-минуте; wen уровень люминесценции опытной пробы на 0-минуте; тр | = — уровень люминесценции контрольной пробы Ha п-минуте; 0 — уровень люминесценции контрольной пробы на 0-минуте.
В качестве базового оборудования для проведения исследований были использованы «Искусственный рубец» KPL-01, люминометр LM-01T (Immunotech, Чехия), рН-метр-иономер Эксперт-001 (Эоникс-Эксперт, Россия), центрифуга лабораторная СМ-6М (Элми, Россия). Экспериментальная часть исследований состояла из физиологического эксперимента, который проводился на фистулированных бычках красной степной породы, в условиях физдвора Покровского сельскохозяйственного колледжа Оренбургского района Оренбургской области. В назале подготовительного периода подопытным животным по методу А.А. Алиева (1998) были установлены фистулы рубца. В течение подготовительного периода эксперимента бычки были переведены на привязное содержание, индивидуальное кормление, на рационы составленных на основе детализированных норм кормления разработанных А.П. Калашниковым и др. (2003). В течение опыта рацион для подопытных животных были сбалансированырассчитанным Haпо получениеосновным 800-900питательнымг среднесуточноговеществам согласнопривеса.нормам,Для определения переваримости крахмала в рубце использовался метод in situ или так называемый метод «нейлоновых мешочков» (Григорьев Н.Г., 1989). Мешочек с 5 г навески корма помещали в рубец: с концентрированными кормами на 3 часа. Химический состав кормов изучался по методикам ы биохимических исследований согласно‘ требованиям ГОСТа, в условиях центра коллективного пользования научным оборудованием Всероссийского НИИ мясного скотоводства (аттестат аккредитации испытательного центра №РОСС RU 0001.21 1459 от 19.05.2011).
Основные данные были подвергнуты статистической обработке с использованием программ «Excel», «Statistica 10.0». Достоверными считали различия при р<0,05. Результаты исследований. При контакте нативной рубиовой жидкости с сенсорными люминесцирующими бактериями E.coli было зарегистрировано дозозависимое ингибирование свечения в первые секунды контакта (рис.17). При этом ко второй минуте контакта «тушение» составило до 5,20 + 0,59 % в случае с исходной средой и убывало в ряду двухкратных разведений до 102,56 + 4,83 % при титре 1:1024. После 30 минут инкубации смеси уровень свечения в пробе с нативной рубповой жидкостью достигает контрольного и с течением времени повышается до 190,59 = 22,15 % после 60 минут контакта. Штамм E.coli katG::lux, в котором клонированный промотор отвечает за синтез каталазы, обеспечивающей — нейтрализацию пероксида — водорода, продемонстрировал индукцию свечения, достигаемую 3,0 относительных единиц на 60 минуте контакта. Изучение генотоксических эффектов, основанное на активации белков системы репарации RecA/LexA с использованием штамма E.coli recA::lux, позволило зарегистрировать эффекты индукции свечения данных бактериальных клеток при контакте с нативной рубцовой жидкостью (рис. 18).
м“ ы
р д 3 ы
в
'
i wo &
zoe Е
Е 8 В
2“ з
. 8
Ca р
°2 4
° © 1024 512 Cremens255 разведении18 рубловойokжадкосты о
т Рис. 17 Уровень люминесцентногоотклика сенсорныхштаммов Ё.сой на2 (А) ибо (B) минуте контакта с различными титрами рубцовой жидкости
р
“
р
*
Е“insов
'
os
°
° 6 в 4 2 В
Степень pamenerais рубоювой жидкости
Рис 18 Индукцияосвечения репортерныхeeштаммов eeпри контактеЕс различными титрами рубцовой жидкости На основе ранее проведенных исследований, а также с учетом сегодняшних результатов был предложен способ биолюминесцентной оценки активности (токсичности) модельной рубцовой жидкости in Vitro. Сущностью предлагаемой заявки на изобретение является проведение ингибирующегооценки токсичности влияниямодельной составныхрубцовой частей модельнойжидкости рубцовойin vitro по жидкости выраженности (РЖ) на интенсивность свечения Escherichia coli K12 ТС] с клонированными luxCDABEинтенсивностьюгенамисвеченияPhotobacteriumтех жеleiognathiлюминесцирующих54010 по сравнениюбактерий вс физиологическом растворе, не содержащем токсического компонента, после рубцовойчего жидкости по формуле: на практике рассчитывают значение токсичности компонентов модельной
"> иЕст enon= убцовой7 eee agбл. Joan — Уровень люминесценции опытной пробы на 0,5-минуте; Tum — Уровень люминесценции опытной пробы на 0-минуте; Тинто» — Уровень люминесценции контрольной пробы на 0-минуте; 15.» — Уровень люминеспенции контрольной пробы на 0,5-минуте. 76
