относительных единиц на 60 минуте контакта. Данныйя факт aia aesто. пероксиданаличии активныхводорода,формспособныхкислорода,диффундироватьв первую очередьв средестабильныхHa з начиantl расстоянияHесмотря и свободнона то, проникать, что предшественником через мембраны клеток.данной формы метаболболитов кислорода является супероксид анион, при су тствие его в среде зарегистрировано не было, что подтверждает отсутствие ответа штамма ииЕ.с
| м специфическийй п промоторр отвечает за синтез регуляторного soxS:белка их,в системе в котор о кислительногоi стресса. С другойit стороны это не отменяет 2 on возможности наличия в среде супероксид аниона, м Ем незначительной продолжительности жизни, он ры ee расстояния от места своего образования и акцептиру компонентами рубцбцовой жидкости. елков Изучение генотоксических эффектов, основанное на weie я lux. системы репарации RecA/LexA с использованием штамма E.coli rec. ie позволило зарегистрировать эффекты индукции свечения да бактериальных клеток п р и контакте с нативной рубцовой жидкостью. Подобныйпероксида водородрезульт а т напроисходитмолекулу ДНК,вследствиелибо лиформибо и р прямогоованияр. ивоздействияНИ идроксильного радикала, вызывающего нарушения в структуре нукля гк и слот,др причем от данного метаболита 6:бактериальная клетка не имеет защитныхподобных генотоксическихмеханизмов. С эффектовдругой выявленостороны, недлябыло,штаммаи уровеньЕсойие acolD::lex не увеличивался при контакте с рубцовой жидкостью. Таким образом, проведенные исследования продемонстрировали возможность оценки токсичности рубцовой жидкости с использованием a ляется прямымсенсорныхотражениемштаммов бактерий,дезинтегрирующегоу которых уровеньхарактералюминесценциидействия средBe Pas клеточные компоненты. пПри этом показана двустадийная зависимость изменения свечения, заключающаяся в первичном его тушении с последующaa дифференциальнойвосстановлением,vaдажебиотоксичности превышающимвыявилоконтрольные.формирован! С другойие стороныактивных теформр
5 ть Ha различные компоненты
бактериальнойкислорода, способных клетки, включая— воздействова ДНК, что является вариантомто: гено’Ht токсического эффекта. ‘A По результатам исследований разработан aaa биохемилюминесцентнойnate!HT Ha изобретениер РФоценки№2603104),токсичностиоснованныйрубцовойя на биолюминесцжидкостиН fing 24реакциичасовой штаммаинкубации Е. Coliв«Эколюм-9»,условиях «искусственноговведенного в рубцовуюрубца»,6 путемжидкость,измерен> послеie в ме на интенсивности свечения бактерий в пробе в НЕПрЕВЫВНОМ рожи микропланшетном люминометре ГМ-01Т, и учета значений по формуле: 143
= 10.5 x12 ТРЖ = 100 — Loner(Cost Контроль).= om) x 100, где ТРЖ - токсичность(Waserрубцовойконтроль) жидкости
ps м own — уровень люминесценции опытной пробы на 0,5-минуте; Г a >. Сы — уровень люминесценции опытной пробы на 0-минуте; мт» — уровень люминесценции контрольной пробы на 0-минуте; IEлено — уровень люминесценции контрольнойг пробы на 0,5-минуте. и при значении ТРЖот о = 19% низкой, от 20 до 49%0 до средней 4% степеньиот 50 токсичности до 100 % высокой. считается нулевой, от5 до Таким образом, по результатам проекта решены следующие задачи: De cee отедонана интегральная охотоксичноске penn НО аа © Reaeaonceil ВЫ, arene aay, свечения биохемилюминесцентныхштамма микроорганизмов на основе рекомбинантного морскогоE.coliлюминесцирующегоK12 ТС1 с клонированнымимикроорганизма luxCDABEPhotobacteriumгенамиleiognathiприродного54010. Определена дифференциальная биологическая токсичность кормового фактора по повреждающему3 ..воздействиюРУна отдельныеме структуры рекомбинантных штаммов E.coli fabA::lux, E.coli ibpA::lux, E.coli recA::luxструктурыи E.coliре cda::lux. п луч Oy EBC A результаты позволили установить EA ESS ингибирующее воздействие на рекомбинантный штамм E.coli, характеризующеесякак цельнойos рубцовойрезкимжидкости,ртушениемполученнойсвечения ужеиз врубцапервыекрупногоминуты контактарогатого скота, так и некоторых ее отдельных компонентов. Так результаты исследований позволили идентифицировать уксусную кислоту как наиболее с сильный детергент в отношении фосфолипидных группировок и повреждения ДНК, основанное на активации белков системы репарации RecA/LexA. Установлена биологическая| активность двухвалентных солейм металлов, возрастающая в следующем порядке — медь — хром — железо. С post naar оценки токсичности рубцовой жидкости с использованиемeee areсенсорныхВОЗМОЖНОСТЬ штаммов я бактерий, у которых уровень люминесценции является прямым отражением ; дезинтегрирующего характера действия среды Ha клеточные компоненты. При я этом м в показана двустадийная зависимость изменения свечения, заключающаяся первичном его тушении с последующим восстановлением, даже биотоксичностипревышающим контрольные.. С другой стороны оценка дифференциальнойм воздействовать выявило формирование активных форм кислорода, способных ДНК, что4) являетсяна вариантомразличные генотоксическогокомпоненты бактериальнойэффекта. c клетки, включая рубцовой жидкостиРазработанin Vitro». «Способ биохемилюминесцентной оценки токсичности 5) Разработана математическая модель прогнозирования результатов биолюминесцентного тестирования межклеточного взаимодействия микроорганизмов рубца жвачных.
бактерий18. Исследованиерубщовой жидкостьюуровня ингибированиякрупного рогатогосистемыскота Quorum
sensing
р Взаимодействие клеток в бактериальных сообществах зачастую осуществляется благодаря ауторегуляторам — веществам различной природы, образуемыми участниками популяции и ими же воспринимаемыми (Bassler, 2006).) Наиболеем типичным вариантомр коммуникацииму АЛЬсреди грамотрицательных бактерий является синтез и восприятие М-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ), причемр последнеем д осуществляетсяох только прир достижении onyопределенной критической плотности популяцииы и называется Quorum sensing (Greenberg, 2003). Подобное взаимодействие направлено на активацию целевых генов, кспрессия которых эффективна придостаточном количестве клеток и, в целом, етоTTВЕН sane5 i) rae(ГСЛ), относящихсясостоянияx групиебактеа гi anonпосле fe —р типа (es 1).oPПри те бактериир п киHoeple A ЕЕ ре обнаруживаемые у свободных форм свойства — свечение, анти Leeeeneeecae :Значимым является тот факт, что у некоторых бактерий система Quorum sensing отвечает за развитие патогенеза, что повышает шансы на эффективность заражения и распространения инфекции. С другой стороны, макроорганизмы зар. распростр ° ру р 2 роор ° (животные или растения) стремятся подавить коммуникационные каналы бактериальныхЕ сообществ, что обеспечивает регулирование их активности, в том числе и вирулентности (Hughes, 2009). Наиболее распространенными видами ингибирования является связывание молекул ГСЛ (зачастую неспецифического), ферментативного расщепления лактонного кольца лактоназами, и образование аналогов аутоиндукторов, не способных i индуцировать целевые гены системы Quorum sensing (Brackman, 2015).я разнообразиеОдним изразличныхспецифическихмикроорганизмов,микробиоценозов,в том числевключающийи бактерий,ii огромноеявляется русецбец жвачных животных. a Считается, ы что некоторыер представителир данного сообщества способны продуцировать не только аутоиндукторы второго типа + : : (АИ-2). (Mitsumori et al., 2003), но и АГЛ (Erickson et al., 2002), однако некоторые исследования доказывают обратное (Кап et al., 2016),. В целом, данные регуляторные молекулы потенциально могут быть восприняты бактериями, не относящимся к нормофлоре рубца, что может привести к азвитию инфекционного процесса. р У С пе see = бцовая жидкость содержит факторы Е ЕЕРТЕЛИЕ И. а id Sco Rt i АГЛ р ее р one oe ут "b a iЕ a позво. Tp! итие микрофло или? труле a 2 ae GornPeeam pi c esrolmmenR bopр бакте р ий или их агрегатов. В связи с этим, целью нашей работы стало исследование способности ‚ молекулярных факторов рубцовой те ee Е Е ОМИ ae ий путем инактивации АГЛ. я к. is }
