Рубцовое пищеварение молодняка крупного рогатого скота под влиянием различных факторов кормления

бактерий18. Исследованиерубщовой жидкостьюуровня ингибированиякрупного рогатогосистемыскота Quorum

sensing

р Взаимодействие клеток в бактериальных сообществах зачастую осуществляется благодаря ауторегуляторам — веществам различной природы, образуемыми участниками популяции и ими же воспринимаемыми (Bassler, 2006).) Наиболеем типичным вариантомр коммуникацииму АЛЬсреди грамотрицательных бактерий является синтез и восприятие М-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ), причемр последнеем д осуществляетсяох только прир достижении onyопределенной критической плотности популяцииы и называется Quorum sensing (Greenberg, 2003). Подобное взаимодействие направлено на активацию целевых генов, кспрессия которых эффективна придостаточном количестве клеток и, в целом, етоTTВЕН sane5 i) rae(ГСЛ), относящихсясостоянияx групиебактеа гi anonпосле fe —р типа (es 1).oPПри те бактериир п киHoeple A ЕЕ ре обнаруживаемые у свободных форм свойства — свечение, анти Leeeeneeecae :Значимым является тот факт, что у некоторых бактерий система Quorum sensing отвечает за развитие патогенеза, что повышает шансы на эффективность заражения и распространения инфекции. С другой стороны, макроорганизмы зар. распростр ° ру р 2 роор ° (животные или растения) стремятся подавить коммуникационные каналы бактериальныхЕ сообществ, что обеспечивает регулирование их активности, в том числе и вирулентности (Hughes, 2009). Наиболее распространенными видами ингибирования является связывание молекул ГСЛ (зачастую неспецифического), ферментативного расщепления лактонного кольца лактоназами, и образование аналогов аутоиндукторов, не способных i индуцировать целевые гены системы Quorum sensing (Brackman, 2015).я разнообразиеОдним изразличныхспецифическихмикроорганизмов,микробиоценозов,в том числевключающийи бактерий,ii огромноеявляется русецбец жвачных животных. a Считается, ы что некоторыер представителир данного сообщества способны продуцировать не только аутоиндукторы второго типа + : : (АИ-2). (Mitsumori et al., 2003), но и АГЛ (Erickson et al., 2002), однако некоторые исследования доказывают обратное (Кап et al., 2016),. В целом, данные регуляторные молекулы потенциально могут быть восприняты бактериями, не относящимся к нормофлоре рубца, что может привести к азвитию инфекционного процесса. р У С пе see = бцовая жидкость содержит факторы Е ЕЕРТЕЛИЕ И. а id Sco Rt i АГЛ р ее р one oe ут "b a iЕ a позво. Tp! итие микрофло или? труле a 2 ae GornPeeam pi c esrolmmenR bopр бакте р ий или их агрегатов. В связи с этим, целью нашей работы стало исследование способности ‚ молекулярных факторов рубцовой те ee Е Е ОМИ ae ий путем инактивации АГЛ. я к. is }

В работе использованы бактериальные штаммы E.coli К12, трансформированные плазмидами с сшивками рецепторных генов (FA/R, lasR от Pseudomonas aueruginosa и [ихВ Vibrio fisheri) и генов свечения (их СРАВЕ) Photorhabdus luminescens (табл. 60). Культивирование осуществляли на LBагаре (Sigma, США) с добавлением 10 мкг/мл доксициклина в течение 18 часов при 37 °С. Далее переносили в ГВ-бульон (Sigma, США) и инкубировали 90 минут при 37 °С для достижения клетками ранней экспоненциальной фазы. В качестве аутоиндукторов использованы N-butyry]-L-homoserinelactone (С4-ГСЛ), | N-(3-oxo)-hexanoyl-L-homoserinelactone (оксо-Сб-ГСЛ) и N- dodecanoy!-L-homoserinelactone (С12-ГСЛ) в диапазоне концентраций от 10° до 107 М. Рубцовая жидкость молодняка крупного рогатого скота была отобрана через фистулу и подвергнута центрифугированию при 5000 об/мин в течении 10 минут. Оценку способности подавлять активность аутоиндукторов осуществляли путем инкубации 10 мкл рубцовой жидкости с ГСЛ равного объема в течении 15 минут при 37 °С, после чего был добавлено 80 мкл суспензии соответствующего биосенсора. Измерение проводили в кинетическом режиме Ha люминометре LM-01T (Immunotech, Чехия) в течение 120 минут, а уровень свечения выражали в RLU (relative luminescent units).

В дальнейшем рассчитывали ВЫ (bioluminescence index) как соотношение RLU на 120 минуте к RLU на 0 минуте. Долю ингибирования АГЛ рассчитывали по формуле:

Pele RLU oy RLUoy Экспериментальные исследования проведены в пятикратных повторах. Расчеты произведены с использованием методов вариационной статистики. Рубцовая жидкость представляет собой поликомпонентный раствор, характеризующийся кислой реакцией среды, следствие чего подавляет свечение

бактериальных биосенсоров, показанное ранее на примере лиофилизированной культуры рекомбинантных штаммов E.coli К12 TG1 препарата «Эколюм» (Logachev её al., 2015). Однако в настоящей работе нами был использован культивируемый штамм, характеризующийся иным уровнем восприятия внешних факторов (Deryabin et al., 2016), в связи с чем на первом этале была изучена кинетика свечения бактерий в присутствии рубцовой жидкости. Среди использованных штаммов только E.coli pAL103 и E.coli pALl04 характеризуются фоновым уровнем свечения, достаточным для аппаратной детекции его кинетики, составляющим 252 + 4 и 12440 + 218 RLU (рис.29).

an — — 100000 100000 3 eas в} | filed Е | ] р £10004 4 и В ы - i: | 100 й a 100 4| | |ВВ.й 9 | "аeseel) ве e | : hb| |8| 9aSВ , PALION РАЁЮ? pALI03. pALI04 pALIOS— рА110б Рис. 29: Диаграммы начального уровня свечения (серые столбцы), ‚ ссреднего уровня свеченияс (черные столбцы) и суммарного накопления свечения за 120 минут экспозиции (белые столбцы) использованных штаммов ЦШаммы E.coli pAL105 и E.coli pAL106, несмотря на достаточный уровень люминесценции,начального свечения,в резульс т атеч е ниемчего временисуммарныйтеряютквантсп о собностьвый выходк характеризуются гораздо меньшими значениями, чем у выше указанных рекомбинантных штаммов бактерий. Нативная рубцовая жидкость демонстрировала выраженное ингибирующее воздействие до 49 % для штамма E.coli pAL103 и 43 % для штамма E.coli pAL104 от контрольных с начала момента контакта. Однако последующая инкубация He вела к качественным изменениям параметров биолюминесценции, ак 60 минуте было зарегистрировано восстановление до 59% и 53% (рис.30). Подобная реакция связана как с особенностями окраски рубцовой жидкости, обуславливающей поглощение квантов света и, как следствие, снижение общей интенсивности люминесценции, так и острой