токсичностью, выраженной значительной ионной силой тестируемых образцов, что ведет к дестабилизации метаболических процессов бактериальной клетки и утрате в первые секунды контакта.
Разведение рубцовой жидкости ожидаемо вело к снижению описанного выше явления, причем при ее концентрации 25% и ниже эффекты тушения свечения меняются в диаметрально противоположном направлении — на первых минутах уровень свечения выше, чем на последней минуте контакта.
‘same
_
tex
90%
#
Е 80%
а
70%
oO
50%
40% 7 55 x a
5 2 8
Концентрация рубцовой жидкости, %
—+— РАЁ103Ha O минуте ~—O— pAL103на 60 минуте
—\— pAL104на 0 минуте —&— pAL104на 60 минуте
Рисунок 30: Зависимость биолюминесцентного индекса штаммов E.coli pAL103 и E.coli
Пороговой концентрацией используемой биологической жидкости, которая не проявляла значительного влияния на свечения используемых бактериальных биосенсоров, определяемое уровнем ЕС (сохранение 80% свечения от контрольных показателей) оказалась 12,5%. Таким образом, данная . концентрация рубцовой жидкости была использована в качестве ингибитора активности ацильных производных гомосеринлактона с целью исключения собственного эффекта подавления свечения, На втором этапе нами была исследована способность рубцовой жидкости осуществлять инактивацию молекул АГЛ, что регистрируется снижением интенсивности люминесцентного отклика по сравнению с пробами,
содержащими только аутоиндуктор в соответствующей концентрации. Оказалось, что эффективность воздействия на ГСЛ < различной длиной ацильного хвоста неодинакова, однако обусловлена не специфичностью воздействия, а по всей видимости, характером реакции биосенсора. Нами были сформированы три группы биосенсоров для оценки активности различных АГЛ, в каждой из которых был штамм, имеющий гены рецепторного белка и соответствующий ему штамм с делецией указанного гена. Реакция штамма Есой pAL101 на С4-ГСЛ развивалась при концентрации 10° Ми выше, причем пиковый уровень люминесценции был зарегистрирован при 10* М и составлял 7030 RLU (рис. 31). В то же время, в ответ на пробу с указанным АГЛ и рубцовой жидкостью данный биосенсор реагировал в целом ниже. Наибольшая ингибирующая способность наблюдалась при минимальной детектируемой концентрации (10% M) и составляет 79%, а с увеличением содержания аутоиндуктора ожидаемо эффективность инактивации снижается вплоть до 19,5% при 104 М, где свечение биосенсора составило 5656 RLU (таблица 2). Делетированный по RhIR штамм E.coli pAL102 не реагировал на С4-ГСЛ и уровень его свечения достоверно не изменялся при воздействии пробы с этим аутоиндуктором и рубцовой жидкостью.
10000 0000000 1000
1000000
10000
2 = а 100 _ 4
$100 /
q 1000
5 о eye
10 к.
®
1 1 1
0 608 607 £06 E05 604 0 608 £07 £06 605 E04 © 608 E07 B06 505 E04
‘С4-Гсл, м ‘оксо-С6-ГСЛ, М 012-70, М
Рисунок 31: Зависимость свечения штаммов от концентрации АГЛ в пробах без рубцовой жидкости (W) и в пробах содержащих рубцовую жидкость (RF).
Несколько иная картина наблюдалась в отношении оксо-С6-ГСЛ, для которого в качестве споцифичного биосенсора был выбран штамм E.coli pAL103. Данные бактериальные клетки воспринимали оксо-Сб-ГСЛ с НИЗКОЙ ИСПОЛЬЗОВАНО eo ae AP Sa asae порогом насыщения при 10° М, выше которой не происходило изменение свечения, сохранявшееся на уровне 1008720-3806 RLU. Таким образом, было достигнуто избыточное количество аутоиндуктора, который обеспечивал
активацию свечения во всех клетках культуры. Рубцовая Жидкость продемонстрировала выраженную инактивирующую способность в отношении оксо-Сб-ГСЛ, максимальное значение которой было достигнуто при 10* Ми составляла 95%, а при концентрациях 107 М и 108 М равна 82% и 32%, соответственно. Воздействие образцов с высокой концентрацией оксо-С6-ГСЛ (от 10° до 104 М), подвергнутых обработке рубцовой жидкостью, на штамм E.coli pAL103 вела к формированию люминесцентного отлика, сопоставимого со свечением проб (Р>0,05), содержащих только аутоиндуктор (986400+17706 RLU). Это свидетельствует о том, что даже после контакта с рубцовой жидкостью в системе оставалось достаточное количество оксо-С6-ГСЛ, способного индуцировать рекомбинантный люминесцирующий штамм. Штамм E.coli pAL104, не способный синтезировать белок LuxR, в присутствии этого же аутоиндуктора не изменял уровня своего свечения во всем диапазоне концентраций и средний уровень люминесценции составил 21648=376 RLU. Пробы, содержащие различные дозы оксо-Сб-ГСЛ совместно с рубцовой жидкостью также характеризовались стабильным неотличимым от контрольного уровня свечением (19961+722 RLU). Это свидетельствует об исключении какого либо влияния как самих аутоидукторов, так и рубцовой жидкости непосредственно на гены люминесценции (/uxCDABE) и эффектовсвидетельствуетингибированияо кворумсвечения.зависимой принадлежности рассматриваемых
Таблица 61- Доля ингибирования свечения рекомбинантных штаммов при контакте с рубцовой жидкостью (ВЕ) и ГСЛ по отношению к пробам только с ГСЛ.
| Probe type | 103 | AHL 107 | concentration, 105 | 105 М | 104 |
| ee | - | - | 7% | 2% | 20% |
| ПОPALIOS+OK0-CS | 95% | 82% | 30% | 5% | 1% |
| E.coli pALI05+C12- HSL+RF | й | й | 27% | 16% | 21% |
Наконец, использованный в нашей работе АГЛ с наибольшей длиной алкильного хвоста, содержащего двенадцать атомов в углеродной цепи, регистрировался с использованием штамма £.coli pAL105. Данный биосенсор позволял детектировать С12-ГСЛ начиная с концентрации 105 М с последующим дозозависимым ростом индукции. Однако уровень люминесцентного отклика данного биосенсора характеризовался низкими значениями свечения (при 10* М С12-ГСЛ равный 170 RLU), что вело к менее значимым изменениям люминесценции. Так, пробы, содержащие рубцовую жидкость и 10° М С12-ГСЛ, характеризовались свечением, на 27% ниже, чем пробы с таким же содержанием аутоиндуктора без рубцовой жидкости.
15
