© облучения проб ультрафиолетовыми лучамн при длине волны {28 им. Для этого пробы переносят пипеткой из кюветы в пробирки из стекла пирекс, закрывают пробками и облучают лампой PK на расстоянии 30 см в течение | ч, Для охлаждения пробирок применяют настольный вентилятор. По разности отсчетов при сиектрофотометрии до н после облучения определяют концентрацию витамина Ав сыворотке крови. Расчеты проводят по формулам: Каротин, мкг=Е вв 480, где Еи— экстинкция раствора при длине волны 460 им; 480— коэффициент для каротина. Витамин A, мкг% = (Es до облучения—Езэв после облучения)Ж X637, где Еззв — экстинкция раствора при длине волны 328 нм; 637 — коэффициент для витамина А. Содержание витамнна А в сыворотке крови определяют у животных всех видов, а каротин — только у крупного рогатого скота, лошадей и птицы Если в лаборатории нет спектрофотометра, определение BATAMHна А проводят по методике, описанной выше. При этом коицентрапию каротиноидов в сыворотке крови определяют в эфирном экстракте, полученном после экстрагирования омыленного образца и высушивания его сульфатом натрия. Во многих лабораториях широко ирнменяется упрощенный метод определения каротина в сыворотке крови без предварительного омыления образца.
Определение каротина в сыворотке крови
Сущность метода. Извлечение каротина из белковых фракций сыворотки крови петролейным или этиловым эфиром с последующим колориметрированием на фотоколориметре при синем светофильтре или со стандартной шкалой двухромовокислого калия. Приборы и посуда. Фотоэлектроколориметр; центрифуги; мерные цилиндры; пробирки центрифужные; пробирки мерные; пипетки; стеклянные палочки. Реактивы. Эфир наркозный или петролейный; спирт этиловый 96%-ный; раствор двухромовокислого калия (720 mrp | a дистиллированной воды); колориметрическая шкала, приготовленная из основного раствора двухромовокислого калия (720 мг KeCr.O7 в 1 a дистиллированной воды). Ход определения. В центрифужную пробирку берут пипеткой 1—3 мл сыворотки (в зависимости от предполагаемого содержания каротина), добавляют 3—6 мл этилового спирта. Пронеходит осаждение белков сыворотки. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой, затем центрифугируют в течение 15 wun, Спирт с осадка сливают, а к осажденному белку добавляют 3—4 мл петролейного нли‘серного эфира, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 10 мин. Прозрачный эфирный экстракт сливают в мерную пробирку, обтем доводят чистым эфиром до 5 мл, закрывают пробкой. В том случае, если после экстракции эфиром белковый осадок нмеет желтую окраску, экстракцию каротина проводят повторно, а полученный экстракт соединяют с первым и измеряют общий объем. Интенсивность окраски эфирного экстракта колориметрируют с раствором двухромовокислого калия на фотоэлектроколориметре. Содержание каротина вычисляют по формуле, приведенной при определении каротина в корме. Расчет ведется на 100 мл сыворотки (в мг). 205
При отсутствии колориметра можно использовать колориметрическую шкалу. Количество каротина высчитывают по формуле:
К.И. 100 r= @ z eae вЕ oxpacxe,OeMs nopeК cae. к oi У— объем эфирного экстракта, мл; ЕВЕ СИ taboporsasten, А > мл; J ленияновной растворкаротина720 мг вК»Сг»Огкормахв 1 aи водысыворотке(1 млмосновногокрови.раство-Ocра соответствует 0,00416| mr каротина) у
- Колориметрическая шкала для определения каротина
| про- №| бирки | | и Основной | раствор, мл | вода, | мл | | Ш и |SMe wa | раствора, т | в | Номер | бирки про- | es | Мы |Основной раствор, мл | | ли и Вода, мл | | | а тие раствора, apd |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 10,0 | 0,0 | 0,004160 | 13 | 4,0 | 6,0 | 0,001664 | |
| 2 | 9,5 | 0,5 | 0,003952 | 14 | 5,5 | 6,5 | 0, 001456 | |
| 3 | 9,0 | 1,0 | 0,003744 | 15 | 3,0 | 7,0 | 0, 001248 | |
| 4 | 8,5 | 1,5 | 0,003536 | 16 | 2,5 | 7,5 | 0,001040 | |
| 5 | 8,0 | 2,0 | 0,003328 | 17 | 2,0 | 8,0 | 0, 000832 | |
| 6 | 7,5 | 2,5 | 0,003120 | 18 | 1,5 | 8,5 | — | 0,000624 |
| 7 | 7,0 | 3,0 | 0,002912 | 19 | 1,0 | 9,0 | 0,000416 | |
| 8 | 6,5 | 3,5 | 0,002704 | 20 | 0,5 | 9,5 | — | 0,000208 |
| 9 | 6,0 | 4,0 | 0,002496 | 21 | 0,4 | 9,5 | 0,000166 | |
| 10 | 5,5 | 4,5 | 0,002288 | 22 | 0,3 | 9,7 | 0,000125 | |
| И | 5,0 | 5,0 | 0,002080 | 23 | 0,2 | 9,8 | 0,000083 | |
| 12 | 4,5 | 5,5 | 0,001872 | 24 | 0,1 | O,8) ы | 0,000042 |
и Определение витаминаА и каротиноидов в яйце Содержание витамина А и каротиноидов в желтке характеризует обеспеченность.птиц А-витаминным питанием и одновременно используетсяОпределениепри оценкевитаминаинкубационныхА. При анализекачествяичногояиц. желтка из средней пробы (10 желтков) в колбу для омыления берут навеску 5 г, добавляют 10 мл дистиллированной воды, перемещивают, затем добавляют 30 мл этилового спирта, снова перемешивают, добавляют 100 мг пирогаллола, 10 мл 60%-ного раствора КОН и нагревают в водяной бане при 90—95?С с обратным холодильником (его можно заменить небольшими химическими воронками) не менее | ч. В процессе омыления смесь в колбе осторожно помешивают круговыми движениями. После омыления колбу охлаждают, содержимое переносят в делительную воронку, куда добавляют 20 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводят этиловым эфиром 4 раза {первый раз 40 мл, затем по 30 мл).
206
В дальнейшем анализ проводят так же, как при определении витамина А в молоке. Сухой остаток иеомыляемой фракции после отгона эфира растворяют в 1—2 мл хлороформа и колориметрируютОпределение каротиноидов. Определение проводят с омылением пробы желтка и без него. В первом случае каротиноиды в яйце определяют одновременно ст в нем витамина А. Берут навеску массой 5—7 г. Омыление и извлечение неомыляемой фракции проводят, как при определении витамина А в яйцах. Обезвоженный эфирный экстракт делят пополам. Одну часть используют для определения витамина A другую — для ОВО ато полученный после отронки эфира, растворяют В 10— 15$ мл бензинау Б-70.у Полученныйй экстрактэк колориметрируютр ва фотоэлектроколориметре с синим светофильтром.Зная экстинкцию испытуемого раствора, по калибровочной кривой находят количество каротина в | мл раствора (мкг). Расчет содержания каротинондов в образце проводят по формуле:
х= EVER ,
G
rye х — количество каротина Bir навески, мкг; К — количество кавой;ротинаУ —в объем1 мл раствора,испытуемогонайденноераствора,по калибровочноймл; С — навеска,кри-г; 2 — пересчет на весь объем раствора (брали '/› часть). В основу определения каротинондов в яйце без омыления положен метод Г. Д. Дубровина с некоторым изменением (по Е. В. Щербакову). В центрифужную пробирку отвешивают 0,2 г желтка из средней пробы и добавляют 3 мл этилового спирта. Желток в спирте тщательно растирают стеклянной палочкой до появления однородной взвеси. Затем содержимое пробирки центрифугируют при 2500 об/мин в течение 5—7 мин, после чего спирт сливают. К осадку добавляют бензин, хорошо перемешивают той же палочкой и центрифугируют до выпадения плотного осадка. Полученный экстракт сливают в мерную пробирку и колориметрируют. Если осадок желтоватого оттенка, экстрагирование бензином повторяют, оберирование.порции экстракта объединяют, после чего проводят колориметСодержание каротиноидов в желтке вычисляют по формуле, приведенной выше.
Определение содержания витамина А в комбикорме, обогащенном этим витамином
Принцип определения тот же, что при определении витамина А в молоке с некоторыми особенностями при омылении и подготовке образца к экстрагированию неомыляемой фракции. Подготовка образца. Пробу комбикорма массой 400 г подвергают тщательному размолу, для чего ее дважды пропускают через мельницу и хорошо перемешивают. Ход анализа. Навеску размолотого комбикорма массой 10— 20 г (в зависимости от дозы внесенного в корм препарата витамина А) помещают в коническую колбу на 250 мл, добавляют 100 мг пиро-
