горло колбы). Затем очень маленькими пордиями при постоянном помешивании палочкой добавляют 50 мл 55%-ного этанола. Колбу закрывают пробкой (ватный тампон, обтянутый полиэтиленовой пленкой).
Цилиндры (или колбы) ставят в механическую качалку и встряхивают в течение двух часов. Содержимое отфильтровывают через сухой бумажный фильтр. Вытяжку разводят в 2—5 раз (используют мерные колбы на 50 мл). В разведенной вытяжке замеряют интенсивность флуоресценции при помощи флуорометра, согласно инструкции, прилагаемой к прибору. Одновременно замеряют интенсивность флуоресценции рабочегоВ пробиркистандартногосо стандартнымраствора.и испытуемым растворами прибазляют на кончике шпателя МаНСОз и Ма252О: (примерно по 0,1 г), смешивают и вновь измеряют флуоресценцию. При этом в стандартном растворе она гасится до нуля. В исследуемых вытяжках остается небольшая флуоресценция, обусловленная посторонними флуоресцирующими веществами. Тушение флуоресценции рекомендуется проводить дважды, так как иногда она протекает медленно. Для этого к пробам повторно добавляют гидросульфит натрия и соду и вновь измеряют флуоресценцию раствора. Содержание рибофлавина в исследуемой желточной массе вычисляют по формуле
(А— B)-0,4-V * C-a у
где х— количество рибофлавина в | г желтка, мкг; А — показания флуорометра для испытуемой вытяжки (первый отсчет); В — показания флуорометра для испытуемой вытяжки после гашения флуоресценции (второй отсчет); С — показания флуорометра для стандартного раствора, содержащего 0,4 мкг рибофлавина в | мл (чаще устанавливают на величину 60—80); 0,4 — содержание рибофлавина в {1 мл стандартного раствора, мкг; а— навеска желтка, г; У — объем вытяжки с учетом разведения, мл. Объем вытяжки с учетом разведения рассчитывают следующим образом: в 5 г желтка, взятых на анализ, содержится 2,5 г воды (содержание влаги в желтке равно 50%). Учитывая добавление 50 мл этанола, объем жидкости составляет 52,5 мл. Так как перед измерением интенсивности флуоресценции фильтрат был разведен в 5 раз, то общий объем (У) составит 262,5 мл (52,5-5). Пример. Показание флуорометра для испытуемого раствора (первый отсчет) 18, после гашения (второй отсчет) 4; показания флуорометра для стандартного раствора 60; навеска желтка 5 г. ‚_ (8—4-0,4.262,6 4 g мкг в 1 г желтка. 60.5
Определение рибофлавина в яичном белке
Среднюю пробу белка тщательно размешивают. В цилиндр © притертой пробкой берут навеску белка около 10 г. Для этого стаканчик с белковой массой взвешивают, затем часть белка переливают в цилиндр. Стаканчик взвешивают повторно, по разнице двух
взвешиваний находят массу взятого для ‘анализа белка (иавёску белка берут так, чтобы не образовалась пена). В белковую массу маленькими порциями при тщательном перемешивании добавляют 50 мл 96%-Horo этанола. Цилиндр закрывают пробкой, энергично встряхивают и оставляют на несколько мниут в покое. После этого записывают объем содержимого цилиндра. Опускают в цилиндр 8—10 стеклянных бусинок, закрывают пробкой и встряхивают в механической качалке в’ течение двух часов. Содержимое цилиндра фильтруют через сухой фильтр и рассчитывают общий объем фильтрата. Пример. Вес пробы белка, взятой на анализ, 13,1 г. Количество87%).влагиПослев пробедобавлення — 11,4 50млмл(среднееэтаноласодержаниеобъем долженвлаги всоставитьбелке— 61,4 мл, но после добавления этанола он уменьшился на 1,3 мл. Окончательный общий объем экстракта составляет 60,1 мл. Величину объема (У) вносят в расчетную формулу. Дальнейший порядок определения и расчет содержания рибофлавина в белке проводится, как и при анализе желтка.
МЕТОДЫ БИОХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯФРАКЦИЙ СЫВОРОТКИОБЩЕГО БЕЛКАКРОВИ И БЕЛКОВЫХ
Ф
Рефрактометрический метод определения белка Определение содержания белка и белковых фракций- в сыворотке крови приобретает все большее значение для оценки состояния обмена веществ животных. Данные показатели могут быть использованы и для оценки полноценности кормления животных. В основе рефрактометрии лежит способность сред различно преломлять проходящие через них лучи света. Луч, переходя из одной средыние синусав другую,угла меняетпадениясвоек синусунаправлениеугла преломления— преломляется.(рефракция)Отношеносит название показателя преломления (коэффициепта преломления). Величина рефракции раствора зависит от количества, величины, физического состояния растворенных в нем частиц и температуВЕВ сывороткеQUOTEкрови величина рефракции зависит; главным образом от количества белка. Минеральные вещества и другие составные части сыворотки практически не оказывают влияния на коэффициент рефракции. Для определения показателя преломления используют специальные приборы-рефрактометры. Рефрактометр РЛУ (лабораторный универсальный) состоит из станины на чугунном основании, к которой на оси укреплена камера прибора, состоящая из нижней и верхней половинок, где установлены осветительная и измерительная призмы. Для поддержания температуры в половинках камеры имеются полости, через которые пропускается вода (подача воды с помощью резиновых шлангов). Температура камеры должна быть 17,5°C (измеряется термометром, укрепленным на штуцере). й На кронштейне установлена зрительная труба, неподвижно соединенная со шкалой коэффициентов преломления. Камера вместе со зрительной трубой с помощью рычага может вращаться вокруг оси. Рефрактометр типа ИРФ-22 работает аналогично. Перед работой прибор необходимо проверить и установить на нуль. Для этого приподнимают верхнюю половину камеры и на призму наносят несколько капель дистиллированной воды, камеру закрывают и устанавливают на резкость окуляр шкалы и окуляр зрительной трубы. Зеркало устанавливают так, чтобы свет от источника через окно поступал в осветительную призму и равномерно освещал поле зрения. Рукояткой устраняют спектральную окраску границ светотени. Указательную линию окуляра шкалы устанавливают на 1,3332 и смотрят в зрительную трубу. Если граница светотени проходитЕсли Очерез hoцентр пересечения pe помощилиний,ключато необходимоприбор установленвращатьнавинтнуль.в зрительной трубе до тех пор, пока граница светотени ие будет в центре пересечения линий. При просмотре большого количества проб необходимо несколько раз проверять установку на нуль. Определение общего белка сыворотки крови. Ход определения.
