Справочник по контролю кормления и содержания животных

После установки прибора на нуль приподнимают верхнюю половниу камеры, вытирают призмы досуха неворсистой салфеткой. Затем на поверхностьВЮ врупризмы нананосятзамок. Вращая1—2 каплирукояткусывороткии наблюдаякрови ив окулярбыстро зрительнойшенность. Затемтрубы, рукояткойнаходят границуточно совмещаютсветотени и границуустраняютсветотениее окра-с точкой пересечения двух линий. Смотрят в окуляр шкалы и проводят отсчет коэффициента преломления раствора, записывают и по шкале Рейсса находят процентное содержание белка (табл. 54). Например, если коэффициент рефракции сыворотки 1,3499, то это соответствует 8,12% белка.

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза на бумаге

Сыворотка крови состоит из нескольких десятков белков, в MOлекулах которых содержатся как основные, так и кислые ионизируемые группы. Ионизация этих групп обусловливает свободный заряд молекул белка. Величина и знак этого заряда разных белков неодинаковы и зависят от соотношения кислых и основных групи в белке, величины pH и ионной силы окружающего раствора. Поэтому если нанести каплю сыворотки на полоску фильтровальной бумаги, смоченной буферным раствором, и пропустить постоянный электрический TOK, TO под воздействием электрического поля молекулы белка начнут перемещаться к полюсу с противоположным зарядом. Скорость перемещения различных белков неодинакова и зависит от величины их свободного заряда и градиента потенциала электрического поля. Кроме того, на передвижение молекул белка влияют электроосмотический ток жидкости, а также ток жидкости, возникающий на бумаге в результате сифонирования и испарения буфера с поверхности Cymer, . Разделение белков на фракции лучше проходит в щелочной cpeде. Белки в среде при РН 8,6 имеют отрицательный заряд и движутся в электрическом поле в сторону анода. Г При помощи электрофореза на бумаге при описываемой методибумины,ке сывороткуол, %2,кровиВ и у-глобулины).можно разделить на пять основных групп (альРеактивы и оборудование. Буферный раствор; краска для окрашивания белка; экстрагирующий раствор; раствор для отмывания не связавшейся с белком краски; камера для электрофореза на бумаге; фотоэлектроколориметр ФЭК-М; желательно в лаборатории иметь денситометр и электронный интегратор; микропипетки; пробирки; хроматографическая бумага. Камера для электрофореза. В литературе описано много конструкций камер для электрофореза на бумаге, которые состоят из электрофоретических камер (ванн), источника постоянного тока и автоматического самопишущего денситометра. Электрофоретическая камера представляет пластмассовую ванну G крышкой. В ванне расположены две свободно вынимающиеся электродные кюветы для буферного раствора, каждая из которых разделена продольной перегородкой пополам на две секции. Электрический ток из одной секции в другую проходит через полоску фильтровальной бумаги, помещаемую на перегородке. Концы фильтро-

215

вальной бумаги опускаются в буферный раствор, в наружную секцию кювет родов, во внутреннюю— концы —вертикальноконцы бумажныхрасположенныхполос. Вугольныхванне имеютсяэлектпризмы, на которые укрепляются бумажные полоски. Крышка камеры имеет двускатную форму, что исключает возможность попадания иа электрофореграмму капель конденсата, образующегося па крышке вследствие испарения буферного раствора. Ванна устанапливяется в горизонтальное положение при помощи регулировочных инитов, вмонтированных в дно. Электрофоретическую камеру можно сделать из плексигласа нли толстого стекла, а заключениые в деревянные рамки электроды— из платиновой проволоки или из пержавеющей стали. Камера для электрофореза должна быть спабжена источником постоянного тока. По дготовка камеры к проведению эл ектро ф о- реза. Крышку камеры открывают, нластинки с электродами отсоединяют от камеры, электродные кюветы наполняют буферным раствором до одинакового уровня. На перегородки кювет помещают полоски фильтровальной бумаги, тем самым соединяя оба отделения каждой кюветы. Контактные планки в вание устанавливают так, чтобы электроды опускались во внешние отделения кювет. Затем готовят бумагу. Для электрофореза. используют хроматографическую бумагу марок «М» (медленная) или «Б» (быстрая) (если электрофореграммы обрабатывают на денситометре, лучше пользоваться бумагой марки «Б>). Хроматографическую бумагу нарезают полосками вдоль волокон. Размер бумажных полос определяется конструкцией камеры. Длина бумажных полос может быть 26, 32, 40—44 см, ширина 3— 4 см. Перед работой на бумажной полосе находят середину, затем, отступая от нее на 3—4 cM, отмечают простым карандашом точку (место нанесения сыворотки), на коротком конце бумажной полоски записывают условия опыта, дату исследования, номер животного aap ik

Приготовленные полосы бумаги смачивают в буферном растворе и немного подсушивают на фильтровальной бумаге. Затем полосы помещают в камеру таким образом, чтобы их концы были погружены в буферный раствор, налитый во внутренние отделения электродных кювет, а средняя часть находилась на призмах или палочках. Конец бумажной полосы, где записаны условия опыта, должен быть обращен к катоду. Этот конец бумаги остается свободным от белков. Затем наносят сыворотку на заранее отмеченный участок бумажной полосы. Нанесение сыворотки. На бумажную полоску наносят 0,01 или 0,005 мл цельной сыворотки. Необходимо всегда наносить строго одинаковое количество сыворотки. Исследуемую сыворотку отмеряют при помощи микропипетки ма 0,1 мл и наносят на бумагу в виде поперечной полоски при помощи пластинки из плексигласа шириной 3,5 см (можно пользоваться покровным стеклом). Отмеренное количество сыворотки размазывают по краю стекла, а затем, перевернув его каплей вниз, прикладывают под острым углом к поверхности бумаги и придерживают в этом положении несколько секунд, пока сыворотка не впитается в бумагу. Сыворотку можно наносить на полоску бумаги непосредственно из микропипетки. В пипетку набирают 0,015 мл сыворотки. Слегка касаясь бумаги, пипетку ‘перемещают по намечениой лолосе (не доводя пипетку на

216