2 мм до каждого края) до тех пор, пока ua бумагу не будет нане| сенопеткой.0,01 мл. Можно также пользоваться автоматической микропиПосле нанесения пробы прибор закрывают крышкой, Ha внутрен* нюю поверхность которой прикрепляют лист фильтровальной бумаги, чтобы конденсирующаяся на крышке жидкость, не попадала в виде капель на электрофореграмму. Прибор включают в сеть и пропускают через бумажные полосы постоянный электрический ток. Электрофорез проводят при градиенте потенциала 3—8 В (для полос 40 см длиной напряжение должно | быть 120—350 В). Сила тока не должна превышать 0,1—0,3 мА на | 1 см поперечного разреза бумажной полосы. Сила тока в цепи зависит от напряжения в сети, природы и величины рН буферного раствора, длины и ширипы бумажных полос, их количества, толщины бумаги и температуры среды. Сила тока прямо пропорциональна ширине бумажных полос и их числу. Например, если в камере 12 бумажных полос шириной 4 cM, на одну полосу сила тока должна быть 0,4—1,2 MA, на 12 полос соответственно 4,8—12,4 мА. Увеличение силы тока более чем вдвое против указанной величины недопустимо, так как при этом происходит нагревание и значительно увеличивается испарение. Хорошее разделение белка на фракции можно получить за 16— 18 ч при напряжении 150—170 В. Электрофорез можно проводить за 10—12 ч при напряжении тока 240—260 В. Сила тока соответетвенно рассчитывается и устанавливается на миллиамперметре источника постоянного тока. Электрофорез обычно проводят при комнатной температуре. Хорошие результаты получаются, когда электрофорез проводится на холоде (3—10°), для этого камеру рекомендуется поместить в холоДИЛЬНикК, i Приготовление буферных растворов. Beponaso* вый буфер (рН 8,6). В.200—300 мл воды растворяют 10,32 г мединала и добавляют 1,84 г веронала. Смесь нагревают в водяной бане до полного растворения веронала. Затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 1 л. Хорошее разделение белка на фракции получается при составе буфера 0,9 г веронала, 5,16 г мединала, 5 г двузамещенного фосфорнокислого натрия. Веронал-ацетатный буфер (pH 8,6). В 300 мл дистиллированной воды растворяют 8,71 г веронала, 1,89 г едкого натрия и 6,48 г уксуснокислого натрия. К раствору приливают 60 мл 0,1 М раствора соляной кислоты н доводят объем дистиллированной воды до 1 л. Буферный раствор из борной кислоты и буры. Хорошее и четкое разделение белка на фракции получается, когда на 1 л дистиллированной воды отвешивают 5,574 г бормой кислоты и 10,489 г буры. Трис-буфер (РН 8,9). При использовании его получается хорошее разделение сыворотки (9 фракций). В 1 a дистиллированной воды растворяют 60,5 г трноксиметиламинометана (трие), 6 г этиленднаминочетырехуксусной кислоты и 4,6 г борной кислоты. Фиксация н окраска белков на бумаге. После окончания электрофореза прибор отключают от сети, снимают крышку камеры и берут бумажные полосы. Избыток влаги на концах удаляют фильтровальной бумагой. 7 Затем бумажные полоски вешают на стеклянные палочки (через палочку перебрасывают тот конец полосы, где записаны условия опыта).
217
Для фиксации белков сухие бумажные полосы на стеклянных палочках помещают на 20 мин в сушильный шкаф, нагретый до 105°. Каждый раз следует соблюдать одни и те же время прогревания и температуру, так как от этого зависит связывание краски белками. Далее проводят окрашивание электрофореграмм, а затем отмывание не связавшейся с белком краски, Окрашивание электрофореграмм проводят в плоских эмалированных кюветах, Электрофореграммы кладут на дно кюветы в развернутом виде (полоски бумаги сворачивать и класть друг на друга нельзя). В кювету наливают один из трех красящих растворов 1. Раствор для окраски кислым сине-черным красителем (краска, аналогичная «амидошварцу 10 В»). Раствор готовят следующим образом: кислый сине-черный краситель— 0,2 г, ледяная уксусная кислотаБумажные—100 мл,полосыметиловыйокрашиваютспирт—этим900 мл.красителем 20 мин. Затем раствор краски сливают (его можно использовать еще несколько раз), а в кювету наливают отмывающую жидкость, которая удаляет не связавшуюся с белками краску. Состав отмывающей жидкости: ледяная уксусная кислота— 100 мл, фенол (расплавленный) — 40 мл, вода водопроводная — 860 мл. Кислый раствор фенола в кювете с электрофореграммами меняют 4—5 раз, пока фон ие станет белым, Кюветы необходимо время от времени покачивать. Долго полоски бумаги держать в кислом растворе фенола нельзя. 2. Красящий раствор с сулемой для окраски бромфеноловым сидянаяним:30 мин.ОкраскубромфеноловыйуксуснаяКраску,бумажныхкислотане связавшуюсясинийполос— 20(индикатор)мл,проводятводас белком,дистиллированнаятакже— 0,5удаляютг,в кюветахсулемапромыванием——в10980течениег, мл.леэлектрофореграммотпокакраски.участкиОтмывающуюбумаги,в 2%-номне содержащиежидкостьрастворесменяютбелок,уксуснойполностьюнесколькокислотынераз.доотмоютсятех пор, ВНЕНИМ:Sp ВЯEACHORомфеноловый —= 50Coeмл, сннийдистиллированнаяpul0,1 teг 21$04.7Н:0водаa —— 900eeмл.г, ледян:aus yeБумажные полосы погружают в кювету с красящим раствором на 8—20 ч. Sema электрофореграммы прополаскивают в 2%-ном ввсколь ь кислоты. Отмывающую жидкость сменяют недухе.ПослеНа ЛЕТИокраски и отмыванияпоявляютсяполоски бумагичетыре высушиваютполоски, соответст-на возa у -, В- и у-глобулинам. Часто а-глобулин разделявующие альбумину, а-, В и у-глобу. В и unУЖИНSEY CHT CELA TEESE, HOGS TE HW GENTETS EEN ERSSSE | FELS Выше hs рическом полебылоявляютсяотмечено, отрицательночто при величинезаряженнымирН 8,6 все ибелкидвижутсяв элект.по направлению к аноду. Быстрее всех движутся альбумины, затем а- тлобулины, за ними В-глобулины, медленнее всех движутся у-глобулины. Поэтому после окраски \у-глобулины оказываются на месте нанесения сыворотки или могут быть сдвинуты в сторону катода (за счет электроосмотического тока). ельных фракций а COREA OUST OTL ‘ Окрашенные и высушенные электрофореграммы можно обрабатывать И инленси1 тВ. не.> аску из бумаги В Инне праскилеми Ии с.НЕТриЗЕКОЕ определение. ее количе-
218
ства. Если границы между фракциями четко видны, электрофореграмму разделяют на поперечные полоски, соответствующие каждой фракции.
электрофоре-
Каждую вырезанную полоску измельчают ножницами, помешают в отдельную пробирху и заливают элюирующим раствором (кислотный сине-черный краситель элюируется 0,1 н. МаОН, к «альбуминовому» участку приливают 30 мл и по 10 мл к «глобулиновым участкам»). й в т”. Бромфеноловый синий элюируется 0,01 н. NaOH или щелочным метанолом. Щелочной метанол для извлечения бромфенолового синего готовят следующим образом: к 500 мл метанола добавляют при перемешивании 500 мл 8%-ного раствора углекислого натрия. Выпавший осадок отфильтровывают. Извлекают краску при комнатнр о йк нт е обходимомпературе периодическив течение | чвстряхивать.в темном месте. Содержимое пробиОкрашенную жидкость после этого колориметрируют в фотоэлектроколорнметре. В контрольную кювету наливают элюат из неокрашенного участка электрофореграммы. Показания фотоэлектроколориметра записывают (экстинкцию для альбуминовой фракции умножают на 3, так как наливают в пробирку 30 мл 0,1 н. МаОН). Пример. Экстинкция (показание колориметра) для альбуминовой фракции — 0,202, для а-глобулиновой— 0,054, В-глобулиновой — 0,039, у-глобулиновой — 0,128. Показания колориметра для всех фракций суммируют: 0,202 ++ 0,054 --0,039 +.0,128 = 0,423. т pon . цент поолученнуюотношениюсуммук нейпринимаютсоставляетза экстинкция100 и вычисляют,каждойкакойиз проб:ца 0,423— 100% 0.202‚202 —х. x = 47,75% альбуминов. kK равноТаким12,76же ыйС образомрывычисляют eyeсодержание а-глобулинов,oo 30.20%п . ре5 оно OT глобулинов 52,24%. Коэффициент A/T равен 47,75 : 51,24= Расчеты можно проводить и в абсолютных величинах. Для этогоцентах.нужно знать содержание общего белка в сыворотке крови в прото Е СН ‚фракциями ere ENS.ree7 . регр У разр р. р 9 CN Е дую полоску помещают в отдельные пробирки, в которые наливают по 5 мл элюирующего раствора. Через | 4 элюат колориметрируют против контрольной пробы из неокрашенного участка электрофореамЕ ОВЕНр ПОТЕ HERES GHEGTR КНЕТИО TTR PRESEN ПО MOTO OLEAN MEMER TT Mota GET) EN GHD cletaiuiae в В ОТ О УЕ ЕН ОЕ ИИ Е Ga ЕСИ ОГИ ИЕ ВОЕН ED ВОО ВО, За вычерчивают кривую, подобную вычерченной денситометром. Полученную кривую делят по минимальным точкам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого О ее о © у ВОДО на У кр Би is белком даннои фракции. По соотношению площадеи пиков, соответНе фракциям, вычисляют отношениеи . между фрак`В 219
