вальной бумаги опускаются в буферный раствор, в наружную секцию кювет родов, во внутреннюю— концы —вертикальноконцы бумажныхрасположенныхполос. Вугольныхванне имеютсяэлектпризмы, на которые укрепляются бумажные полоски. Крышка камеры имеет двускатную форму, что исключает возможность попадания иа электрофореграмму капель конденсата, образующегося па крышке вследствие испарения буферного раствора. Ванна устанапливяется в горизонтальное положение при помощи регулировочных инитов, вмонтированных в дно. Электрофоретическую камеру можно сделать из плексигласа нли толстого стекла, а заключениые в деревянные рамки электроды— из платиновой проволоки или из пержавеющей стали. Камера для электрофореза должна быть спабжена источником постоянного тока. По дготовка камеры к проведению эл ектро ф о- реза. Крышку камеры открывают, нластинки с электродами отсоединяют от камеры, электродные кюветы наполняют буферным раствором до одинакового уровня. На перегородки кювет помещают полоски фильтровальной бумаги, тем самым соединяя оба отделения каждой кюветы. Контактные планки в вание устанавливают так, чтобы электроды опускались во внешние отделения кювет. Затем готовят бумагу. Для электрофореза. используют хроматографическую бумагу марок «М» (медленная) или «Б» (быстрая) (если электрофореграммы обрабатывают на денситометре, лучше пользоваться бумагой марки «Б>). Хроматографическую бумагу нарезают полосками вдоль волокон. Размер бумажных полос определяется конструкцией камеры. Длина бумажных полос может быть 26, 32, 40—44 см, ширина 3— 4 см. Перед работой на бумажной полосе находят середину, затем, отступая от нее на 3—4 cM, отмечают простым карандашом точку (место нанесения сыворотки), на коротком конце бумажной полоски записывают условия опыта, дату исследования, номер животного aap ik
Приготовленные полосы бумаги смачивают в буферном растворе и немного подсушивают на фильтровальной бумаге. Затем полосы помещают в камеру таким образом, чтобы их концы были погружены в буферный раствор, налитый во внутренние отделения электродных кювет, а средняя часть находилась на призмах или палочках. Конец бумажной полосы, где записаны условия опыта, должен быть обращен к катоду. Этот конец бумаги остается свободным от белков. Затем наносят сыворотку на заранее отмеченный участок бумажной полосы. Нанесение сыворотки. На бумажную полоску наносят 0,01 или 0,005 мл цельной сыворотки. Необходимо всегда наносить строго одинаковое количество сыворотки. Исследуемую сыворотку отмеряют при помощи микропипетки ма 0,1 мл и наносят на бумагу в виде поперечной полоски при помощи пластинки из плексигласа шириной 3,5 см (можно пользоваться покровным стеклом). Отмеренное количество сыворотки размазывают по краю стекла, а затем, перевернув его каплей вниз, прикладывают под острым углом к поверхности бумаги и придерживают в этом положении несколько секунд, пока сыворотка не впитается в бумагу. Сыворотку можно наносить на полоску бумаги непосредственно из микропипетки. В пипетку набирают 0,015 мл сыворотки. Слегка касаясь бумаги, пипетку ‘перемещают по намечениой лолосе (не доводя пипетку на
216
2 мм до каждого края) до тех пор, пока ua бумагу не будет нане| сенопеткой.0,01 мл. Можно также пользоваться автоматической микропиПосле нанесения пробы прибор закрывают крышкой, Ha внутрен* нюю поверхность которой прикрепляют лист фильтровальной бумаги, чтобы конденсирующаяся на крышке жидкость, не попадала в виде капель на электрофореграмму. Прибор включают в сеть и пропускают через бумажные полосы постоянный электрический ток. Электрофорез проводят при градиенте потенциала 3—8 В (для полос 40 см длиной напряжение должно | быть 120—350 В). Сила тока не должна превышать 0,1—0,3 мА на | 1 см поперечного разреза бумажной полосы. Сила тока в цепи зависит от напряжения в сети, природы и величины рН буферного раствора, длины и ширипы бумажных полос, их количества, толщины бумаги и температуры среды. Сила тока прямо пропорциональна ширине бумажных полос и их числу. Например, если в камере 12 бумажных полос шириной 4 cM, на одну полосу сила тока должна быть 0,4—1,2 MA, на 12 полос соответственно 4,8—12,4 мА. Увеличение силы тока более чем вдвое против указанной величины недопустимо, так как при этом происходит нагревание и значительно увеличивается испарение. Хорошее разделение белка на фракции можно получить за 16— 18 ч при напряжении 150—170 В. Электрофорез можно проводить за 10—12 ч при напряжении тока 240—260 В. Сила тока соответетвенно рассчитывается и устанавливается на миллиамперметре источника постоянного тока. Электрофорез обычно проводят при комнатной температуре. Хорошие результаты получаются, когда электрофорез проводится на холоде (3—10°), для этого камеру рекомендуется поместить в холоДИЛЬНикК, i Приготовление буферных растворов. Beponaso* вый буфер (рН 8,6). В.200—300 мл воды растворяют 10,32 г мединала и добавляют 1,84 г веронала. Смесь нагревают в водяной бане до полного растворения веронала. Затем объем раствора доводят дистиллированной водой до 1 л. Хорошее разделение белка на фракции получается при составе буфера 0,9 г веронала, 5,16 г мединала, 5 г двузамещенного фосфорнокислого натрия. Веронал-ацетатный буфер (pH 8,6). В 300 мл дистиллированной воды растворяют 8,71 г веронала, 1,89 г едкого натрия и 6,48 г уксуснокислого натрия. К раствору приливают 60 мл 0,1 М раствора соляной кислоты н доводят объем дистиллированной воды до 1 л. Буферный раствор из борной кислоты и буры. Хорошее и четкое разделение белка на фракции получается, когда на 1 л дистиллированной воды отвешивают 5,574 г бормой кислоты и 10,489 г буры. Трис-буфер (РН 8,9). При использовании его получается хорошее разделение сыворотки (9 фракций). В 1 a дистиллированной воды растворяют 60,5 г трноксиметиламинометана (трие), 6 г этиленднаминочетырехуксусной кислоты и 4,6 г борной кислоты. Фиксация н окраска белков на бумаге. После окончания электрофореза прибор отключают от сети, снимают крышку камеры и берут бумажные полосы. Избыток влаги на концах удаляют фильтровальной бумагой. 7 Затем бумажные полоски вешают на стеклянные палочки (через палочку перебрасывают тот конец полосы, где записаны условия опыта).
217
Для фиксации белков сухие бумажные полосы на стеклянных палочках помещают на 20 мин в сушильный шкаф, нагретый до 105°. Каждый раз следует соблюдать одни и те же время прогревания и температуру, так как от этого зависит связывание краски белками. Далее проводят окрашивание электрофореграмм, а затем отмывание не связавшейся с белком краски, Окрашивание электрофореграмм проводят в плоских эмалированных кюветах, Электрофореграммы кладут на дно кюветы в развернутом виде (полоски бумаги сворачивать и класть друг на друга нельзя). В кювету наливают один из трех красящих растворов 1. Раствор для окраски кислым сине-черным красителем (краска, аналогичная «амидошварцу 10 В»). Раствор готовят следующим образом: кислый сине-черный краситель— 0,2 г, ледяная уксусная кислотаБумажные—100 мл,полосыметиловыйокрашиваютспирт—этим900 мл.красителем 20 мин. Затем раствор краски сливают (его можно использовать еще несколько раз), а в кювету наливают отмывающую жидкость, которая удаляет не связавшуюся с белками краску. Состав отмывающей жидкости: ледяная уксусная кислота— 100 мл, фенол (расплавленный) — 40 мл, вода водопроводная — 860 мл. Кислый раствор фенола в кювете с электрофореграммами меняют 4—5 раз, пока фон ие станет белым, Кюветы необходимо время от времени покачивать. Долго полоски бумаги держать в кислом растворе фенола нельзя. 2. Красящий раствор с сулемой для окраски бромфеноловым сидянаяним:30 мин.ОкраскубромфеноловыйуксуснаяКраску,бумажныхкислотане связавшуюсясинийполос— 20(индикатор)мл,проводятводас белком,дистиллированнаятакже— 0,5удаляютг,в кюветахсулемапромыванием——в10980течениег, мл.леэлектрофореграммотпокакраски.участкиОтмывающуюбумаги,в 2%-номне содержащиежидкостьрастворесменяютбелок,уксуснойполностьюнесколькокислотынераз.доотмоютсятех пор, ВНЕНИМ:Sp ВЯEACHORомфеноловый —= 50Coeмл, сннийдистиллированнаяpul0,1 teг 21$04.7Н:0водаa —— 900eeмл.г, ледян:aus yeБумажные полосы погружают в кювету с красящим раствором на 8—20 ч. Sema электрофореграммы прополаскивают в 2%-ном ввсколь ь кислоты. Отмывающую жидкость сменяют недухе.ПослеНа ЛЕТИокраски и отмыванияпоявляютсяполоски бумагичетыре высушиваютполоски, соответст-на возa у -, В- и у-глобулинам. Часто а-глобулин разделявующие альбумину, а-, В и у-глобу. В и unУЖИНSEY CHT CELA TEESE, HOGS TE HW GENTETS EEN ERSSSE | FELS Выше hs рическом полебылоявляютсяотмечено, отрицательночто при величинезаряженнымирН 8,6 все ибелкидвижутсяв элект.по направлению к аноду. Быстрее всех движутся альбумины, затем а- тлобулины, за ними В-глобулины, медленнее всех движутся у-глобулины. Поэтому после окраски \у-глобулины оказываются на месте нанесения сыворотки или могут быть сдвинуты в сторону катода (за счет электроосмотического тока). ельных фракций а COREA OUST OTL ‘ Окрашенные и высушенные электрофореграммы можно обрабатывать И инленси1 тВ. не.> аску из бумаги В Инне праскилеми Ии с.НЕТриЗЕКОЕ определение. ее количе-
218
