Справочник по контролю кормления и содержания животных

ства. Если границы между фракциями четко видны, электрофореграмму разделяют на поперечные полоски, соответствующие каждой фракции.

электрофоре-

Каждую вырезанную полоску измельчают ножницами, помешают в отдельную пробирху и заливают элюирующим раствором (кислотный сине-черный краситель элюируется 0,1 н. МаОН, к «альбуминовому» участку приливают 30 мл и по 10 мл к «глобулиновым участкам»). й в т”. Бромфеноловый синий элюируется 0,01 н. NaOH или щелочным метанолом. Щелочной метанол для извлечения бромфенолового синего готовят следующим образом: к 500 мл метанола добавляют при перемешивании 500 мл 8%-ного раствора углекислого натрия. Выпавший осадок отфильтровывают. Извлекают краску при комнатнр о йк нт е обходимомпературе периодическив течение | чвстряхивать.в темном месте. Содержимое пробиОкрашенную жидкость после этого колориметрируют в фотоэлектроколорнметре. В контрольную кювету наливают элюат из неокрашенного участка электрофореграммы. Показания фотоэлектроколориметра записывают (экстинкцию для альбуминовой фракции умножают на 3, так как наливают в пробирку 30 мл 0,1 н. МаОН). Пример. Экстинкция (показание колориметра) для альбуминовой фракции — 0,202, для а-глобулиновой— 0,054, В-глобулиновой — 0,039, у-глобулиновой — 0,128. Показания колориметра для всех фракций суммируют: 0,202 ++ 0,054 --0,039 +.0,128 = 0,423. т pon . цент поолученнуюотношениюсуммук нейпринимаютсоставляетза экстинкция100 и вычисляют,каждойкакойиз проб:ца 0,423— 100% 0.202‚202 —х. x = 47,75% альбуминов. kK равноТаким12,76же ыйС образомрывычисляют eyeсодержание а-глобулинов,oo 30.20%п . ре5 оно OT глобулинов 52,24%. Коэффициент A/T равен 47,75 : 51,24= Расчеты можно проводить и в абсолютных величинах. Для этогоцентах.нужно знать содержание общего белка в сыворотке крови в прото Е СН ‚фракциями ere ENS.ree7 . регр У разр р. р 9 CN Е дую полоску помещают в отдельные пробирки, в которые наливают по 5 мл элюирующего раствора. Через | 4 элюат колориметрируют против контрольной пробы из неокрашенного участка электрофореамЕ ОВЕНр ПОТЕ HERES GHEGTR КНЕТИО TTR PRESEN ПО MOTO OLEAN MEMER TT Mota GET) EN GHD cletaiuiae в В ОТ О УЕ ЕН ОЕ ИИ Е Ga ЕСИ ОГИ ИЕ ВОЕН ED ВОО ВО, За вычерчивают кривую, подобную вычерченной денситометром. Полученную кривую делят по минимальным точкам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого О ее о © у ВОДО на У кр Би is белком даннои фракции. По соотношению площадеи пиков, соответНе фракциям, вычисляют отношениеи . между фрак`В 219

Площадь всей электрофореграммы и отдельных участков опре-

деляют двумя способами: а) планиметром, с помошью которого определяют общую площадь электрофореграммы, вычерченной на миллиметровой бумаге, и площадь отдельных пиков, соответствующих отдельным фракциям белка . Величину общей площади электрофореграммы принимают за 100, а затем вычисляют, какой процент по отношению к ней составляет площадь каждого пика; 6) нарисованную на миллиметровой бумаге электрофореграмму вырезают пожницами и взвешивают; затем бумагу разрезают между пиками и взвешивают каждый пик отдельно. Общую массу электрофореграммы принимают за 100 и вычисляют, какой процент по отношению к нему составляет массу каждого пика, Последний способ более точен и при использовании торзионных или электроаналитических весов менее трудоемок. Описанные выше расчеты позволяют получить данные о величине отдельных фракций в относительных величинах. Можно вычислить абсолютное количество отдельных фракций белка. Для этого нужно определить общее содержание белка сыворотки крови по Кьельдалю или при помощи рефрактометра Пример. Найдено, что общий белок сыворотки крови равен 8%. Общее количество белка принимают за 100%, а ранее найденное количество альбумина (в относительных величинах) принимают за X: 8— 100 х— 3,82% альбумина. х- 46,75 Таким же образом рассчитывают абсолютное количество других я : 90) В. Н = фракций. Так, содержание а-глобулинов равно 1,02%, В-глобулинов 0,74%, у-глобулинов 4.18%. Коэффициент A/T— 2,424.равен Общее0,91. количество глобулинов равно При определении отдельных фракций белка пользуются денситометром, которыи» вычерчивает кривую, а затем определяют число от. a дельных фракций. Удобно пользоваться денситометром одновременно скаждойЕэлектроннымфракции.интегратором, дающим показания величины площади Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом (по Олл — Маккорду в модификации С. А. Карпюка)

Принцип метода основан на свойстве фосфатных растворов различной концентрации осаждать белки. Величину оптической плотности растворов с определенными белковымн фракциями определяют на фотоэлектроколориметре. Приборы, посуда, реактивы. Фотоэлектроколориметр; бюретка; пнпетки; пробирки с притертыми пробками; мерные колбы; однозамещенный фосфорнокислый калий; едкий натрДля получения основного раствора добавляют 226,8 г КН.РО: к 400 мл раствора, содержащего 33,5 г NaOH. Размешивают до полного растворения, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора дистиллированной водой до 500 мл (или до массы 667,5 г). Далее готовят четыре разведенных фосфатных раствора. Раствор 1. Вносят 92,6 мл (или 123,5 г) основного фосфат-

ного раствора в мерную колбу на 100 мл и доводят дистиллироваиной водой до метки. Раствор 2. К 75,0 мл (или 100 г) основного фосфатного раствора добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл. Раствор 3. К 58,8 мл (или 78,5 г) основного фосфатиого раствора добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл. Раствор 4. К 48,7 мл (или 65 г) основного раствора добавляют дистиллированную воду до объема 100 мл. 5. После добавления воды растворы тщательно перемешивают. При хранении разведенных растворов добавляют ло одной капле хлороформа на 100 мл раствора (для предупреждения бактернальшого загрязнения). Ход определения. В штатив устанавливают 6 пробирок на 10— 15 мл, нумеруют их цифрами (0, 1, 2, 3, 4, 5). В пробирку «0» отмеривают 10 мл дистиллированной воды, в пробирки 1, 2, Зи 4 вносят по 5 мл разведенных фосфатных растворов (растворы 1—4). В пробирку 5 отмеривают 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного фосфатного раствора. Содержимое пробирки 5) перемешивают, а затем из пее переносят по 0,5 мл смеси в пробирки 1—4, а в пробирку «0» добавляют 1 мл. Содержимое каждой пробирки тщательно перемешивают, избегая образования пузырьков воздуха. Через 15 мин определяют оптическую плотность растворов в пробирках 1—4 на фотоэлектроколориметре при красном светофильтре, пользуясь кюветами шириной 10 мм. В качестве контроля используют раствор в пробирке «0». После измерения оптической сти COS PKE MOR ORTDUCHDOrgsSagem ROBOng na Cuer. Из показа-, й оптической плотности раствора пробирки | вычитают этот же RUMAEROM maa ©. № G ii agp6уминов. робиркиДалее из 2.оптическойРазность плотностибудет равнасодержимогооптической плотностпробирк и т тотже показатель пробирки 3. Разность составит оптисти уюпообиркиплотность3 вычитаюта-глобулинов.таковуюАналогичнопробирки 4.изРазностьоптическойбудетплотно-птий И aaностью В-глобулинов.yy А робироптическаяi плотностьн удесодержиказателимого пробиркир разностир 4 будетудетоптическойравна плотноститаковойa у-глобулинов.ТОбУЛиНОВ,пробирок 1—4GarcMmEcellonЗатехсуммируют,0: принимая сумму оптических плотностей за 160, вычисляют содержаниеЕ oat проще тах. Для этого содержание общего de определяют ЕЕ рическим способом (табл. 55). Принимая количество общего белка