Для фиксации белков сухие бумажные полосы на стеклянных палочках помещают на 20 мин в сушильный шкаф, нагретый до 105°. Каждый раз следует соблюдать одни и те же время прогревания и температуру, так как от этого зависит связывание краски белками. Далее проводят окрашивание электрофореграмм, а затем отмывание не связавшейся с белком краски, Окрашивание электрофореграмм проводят в плоских эмалированных кюветах, Электрофореграммы кладут на дно кюветы в развернутом виде (полоски бумаги сворачивать и класть друг на друга нельзя). В кювету наливают один из трех красящих растворов 1. Раствор для окраски кислым сине-черным красителем (краска, аналогичная «амидошварцу 10 В»). Раствор готовят следующим образом: кислый сине-черный краситель— 0,2 г, ледяная уксусная кислотаБумажные—100 мл,полосыметиловыйокрашиваютспирт—этим900 мл.красителем 20 мин. Затем раствор краски сливают (его можно использовать еще несколько раз), а в кювету наливают отмывающую жидкость, которая удаляет не связавшуюся с белками краску. Состав отмывающей жидкости: ледяная уксусная кислота— 100 мл, фенол (расплавленный) — 40 мл, вода водопроводная — 860 мл. Кислый раствор фенола в кювете с электрофореграммами меняют 4—5 раз, пока фон ие станет белым, Кюветы необходимо время от времени покачивать. Долго полоски бумаги держать в кислом растворе фенола нельзя. 2. Красящий раствор с сулемой для окраски бромфеноловым сидянаяним:30 мин.ОкраскубромфеноловыйуксуснаяКраску,бумажныхкислотане связавшуюсясинийполос— 20(индикатор)мл,проводятводас белком,дистиллированнаятакже— 0,5удаляютг,в кюветахсулемапромыванием——в10980течениег, мл.леэлектрофореграммотпокакраски.участкиОтмывающуюбумаги,в 2%-номне содержащиежидкостьрастворесменяютбелок,уксуснойполностьюнесколькокислотынераз.доотмоютсятех пор, ВНЕНИМ:Sp ВЯEACHORомфеноловый —= 50Coeмл, сннийдистиллированнаяpul0,1 teг 21$04.7Н:0водаa —— 900eeмл.г, ледян:aus yeБумажные полосы погружают в кювету с красящим раствором на 8—20 ч. Sema электрофореграммы прополаскивают в 2%-ном ввсколь ь кислоты. Отмывающую жидкость сменяют недухе.ПослеНа ЛЕТИокраски и отмыванияпоявляютсяполоски бумагичетыре высушиваютполоски, соответст-на возa у -, В- и у-глобулинам. Часто а-глобулин разделявующие альбумину, а-, В и у-глобу. В и unУЖИНSEY CHT CELA TEESE, HOGS TE HW GENTETS EEN ERSSSE | FELS Выше hs рическом полебылоявляютсяотмечено, отрицательночто при величинезаряженнымирН 8,6 все ибелкидвижутсяв элект.по направлению к аноду. Быстрее всех движутся альбумины, затем а- тлобулины, за ними В-глобулины, медленнее всех движутся у-глобулины. Поэтому после окраски \у-глобулины оказываются на месте нанесения сыворотки или могут быть сдвинуты в сторону катода (за счет электроосмотического тока). ельных фракций а COREA OUST OTL ‘ Окрашенные и высушенные электрофореграммы можно обрабатывать И инленси1 тВ. не.> аску из бумаги В Инне праскилеми Ии с.НЕТриЗЕКОЕ определение. ее количе-
218
ства. Если границы между фракциями четко видны, электрофореграмму разделяют на поперечные полоски, соответствующие каждой фракции.
электрофоре-
Каждую вырезанную полоску измельчают ножницами, помешают в отдельную пробирху и заливают элюирующим раствором (кислотный сине-черный краситель элюируется 0,1 н. МаОН, к «альбуминовому» участку приливают 30 мл и по 10 мл к «глобулиновым участкам»). й в т”. Бромфеноловый синий элюируется 0,01 н. NaOH или щелочным метанолом. Щелочной метанол для извлечения бромфенолового синего готовят следующим образом: к 500 мл метанола добавляют при перемешивании 500 мл 8%-ного раствора углекислого натрия. Выпавший осадок отфильтровывают. Извлекают краску при комнатнр о йк нт е обходимомпературе периодическив течение | чвстряхивать.в темном месте. Содержимое пробиОкрашенную жидкость после этого колориметрируют в фотоэлектроколорнметре. В контрольную кювету наливают элюат из неокрашенного участка электрофореграммы. Показания фотоэлектроколориметра записывают (экстинкцию для альбуминовой фракции умножают на 3, так как наливают в пробирку 30 мл 0,1 н. МаОН). Пример. Экстинкция (показание колориметра) для альбуминовой фракции — 0,202, для а-глобулиновой— 0,054, В-глобулиновой — 0,039, у-глобулиновой — 0,128. Показания колориметра для всех фракций суммируют: 0,202 ++ 0,054 --0,039 +.0,128 = 0,423. т pon . цент поолученнуюотношениюсуммук нейпринимаютсоставляетза экстинкция100 и вычисляют,каждойкакойиз проб:ца 0,423— 100% 0.202‚202 —х. x = 47,75% альбуминов. kK равноТаким12,76же ыйС образомрывычисляют eyeсодержание а-глобулинов,oo 30.20%п . ре5 оно OT глобулинов 52,24%. Коэффициент A/T равен 47,75 : 51,24= Расчеты можно проводить и в абсолютных величинах. Для этогоцентах.нужно знать содержание общего белка в сыворотке крови в прото Е СН ‚фракциями ere ENS.ree7 . регр У разр р. р 9 CN Е дую полоску помещают в отдельные пробирки, в которые наливают по 5 мл элюирующего раствора. Через | 4 элюат колориметрируют против контрольной пробы из неокрашенного участка электрофореамЕ ОВЕНр ПОТЕ HERES GHEGTR КНЕТИО TTR PRESEN ПО MOTO OLEAN MEMER TT Mota GET) EN GHD cletaiuiae в В ОТ О УЕ ЕН ОЕ ИИ Е Ga ЕСИ ОГИ ИЕ ВОЕН ED ВОО ВО, За вычерчивают кривую, подобную вычерченной денситометром. Полученную кривую делят по минимальным точкам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого О ее о © у ВОДО на У кр Би is белком даннои фракции. По соотношению площадеи пиков, соответНе фракциям, вычисляют отношениеи . между фрак`В 219
Площадь всей электрофореграммы и отдельных участков опре-
деляют двумя способами: а) планиметром, с помошью которого определяют общую площадь электрофореграммы, вычерченной на миллиметровой бумаге, и площадь отдельных пиков, соответствующих отдельным фракциям белка . Величину общей площади электрофореграммы принимают за 100, а затем вычисляют, какой процент по отношению к ней составляет площадь каждого пика; 6) нарисованную на миллиметровой бумаге электрофореграмму вырезают пожницами и взвешивают; затем бумагу разрезают между пиками и взвешивают каждый пик отдельно. Общую массу электрофореграммы принимают за 100 и вычисляют, какой процент по отношению к нему составляет массу каждого пика, Последний способ более точен и при использовании торзионных или электроаналитических весов менее трудоемок. Описанные выше расчеты позволяют получить данные о величине отдельных фракций в относительных величинах. Можно вычислить абсолютное количество отдельных фракций белка. Для этого нужно определить общее содержание белка сыворотки крови по Кьельдалю или при помощи рефрактометра Пример. Найдено, что общий белок сыворотки крови равен 8%. Общее количество белка принимают за 100%, а ранее найденное количество альбумина (в относительных величинах) принимают за X: 8— 100 х— 3,82% альбумина. х- 46,75 Таким же образом рассчитывают абсолютное количество других я : 90) В. Н = фракций. Так, содержание а-глобулинов равно 1,02%, В-глобулинов 0,74%, у-глобулинов 4.18%. Коэффициент A/T— 2,424.равен Общее0,91. количество глобулинов равно При определении отдельных фракций белка пользуются денситометром, которыи» вычерчивает кривую, а затем определяют число от. a дельных фракций. Удобно пользоваться денситометром одновременно скаждойЕэлектроннымфракции.интегратором, дающим показания величины площади Определение белковых фракций сыворотки крови экспресс-методом (по Олл — Маккорду в модификации С. А. Карпюка)
Принцип метода основан на свойстве фосфатных растворов различной концентрации осаждать белки. Величину оптической плотности растворов с определенными белковымн фракциями определяют на фотоэлектроколориметре. Приборы, посуда, реактивы. Фотоэлектроколориметр; бюретка; пнпетки; пробирки с притертыми пробками; мерные колбы; однозамещенный фосфорнокислый калий; едкий натрДля получения основного раствора добавляют 226,8 г КН.РО: к 400 мл раствора, содержащего 33,5 г NaOH. Размешивают до полного растворения, охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора дистиллированной водой до 500 мл (или до массы 667,5 г). Далее готовят четыре разведенных фосфатных раствора. Раствор 1. Вносят 92,6 мл (или 123,5 г) основного фосфат-
