очистки с помощью хроматографии. Кели образец пе подвергался хроматографическому анализу перед определением витамина А (to Карр-Прайсу), его содержание рассматривают как суммарное количество витамина А и каротина. Количество каротина в молоке по отношению к витамииу А coставляет 30—45% и более, но каротии дает окраску с треххлористой сурьмой во много раз слабее, чем витамин А. ‘
Определение витамина А в печени
Содержание витамина А в печени рассматривается как показатель, отражающий степень обеспеченности организма этим витамиHOM. Количество витамина А в печени зависит от вида животных, их возраста, условий кормления и др. Например, в печени коров к копцу пастбищиного сезона содержится 14—20 mr% витамина A, зизапасмой приИдовлетворительном810 мгф, апоступленииand педостаткекаротинакаротинас кормомв рационеего снижается до 6—1,5 mr%. Печень новорожденных телят содержит 0,1—0,5 mr% витамина A. Ход определения. Среднюю пробу печени у жвачных животных (до 100 г) берут из одной и той же доли, тщательно измельчают или растирают в ступке. У птицы для анализа используют всю печень.К навеске 2—5 г гомогенизированного образца печени, взятой в колбу для омыления, добавляют 10 мл 60%-ного раствора КОН и 30 мл этилового спирта, 100 мг пирогаллола. Омыляют на водяной бане при 80°C в течение 1,5—2 4, периодически встряхивая колбу круговыми движениями. После омыления содержимое колбы охлаждают под струей воды до комнатной температуры. В колбу с омыленным раствором добавляют 50 мл эфира, осторожно смешивают н переносят в первую делительную воронку для экстракции. В дальнейшем анализ провоWIT так же, как при определении витамина А в молоке. Сухой остаток после отгона эфира растворяют в 3—5 мл хлороформа и колориметрируют. Если при колориметрировании окраска очень интенсивна, первоначальный хлороформный раствор разбавляют чистым хлороформом. В таком случае берут 1 мл испытуемого хлороформного раствора и к нему прибавляют 4—5—10 мл хлороформа, а при подсчете количества витамина А учитывают степень разведения, т.е. объем всего хлороформа, взятого на растворение сухого остатка.
Определение витамина А в сыворотке крови Содержание витамина А в сыворотке крови определяют колориметрическим или спектрофотометрическим методом. В колбу берут не менее 10 мл сыворотки крови, добавляют 10 мл этилового спирта, 3 мл 60%-ного раствора КОН и 100 мг, пирогаллола. Омыляют в течение 30 мин на водяной бане при 60°C, затем охлаждают. Экстрагируют серным эфиром один раз 30 мл, затем Сухой остаток после отгона эфира растворют в 1—2 мл хлоротри гы Вол. 4форма,мл растворазатем отбираюттреххлористой0,4 млсурьмыполученногои колоримерас т ворарируют.и добавляютСодержание витамина А в сыворотке крови рассчитывают, как и в молоке.
203
Определение витамина А на основе реакции Карр—Прайса с треххлористой сурьмой имеет недостатки. Один из них — чувствительность реакции к влаге и необходимость отмывать кюветы соляной кислотой и водой с последующим высушиванием. Кроме того, для определения витамина А этим методом требуется большое количество сыворотки крови, что не всегда возможно, так как из одной пробы крови одновременно отбирают часть сыворотки для исследования в ней мииеральшых веществ, кетоновых тел, каротина и других витаминов.Для определения содержания витамина А в меньших количествах сыворотки крови предложен спектрофотометрический метод Бессея в модификации А. А. Анисовой с дополнениями, внесенными доцентом кафедры терапии Московской ветеринарной академии И. П. Копдрахиным. Спектрофотометрический способ много проше и точнее. При этом нет необходимости готовить стандартные растворы и строить калибровочную кривую. К тому же можно параллельно определять содержание каротина B сыворотке крови. Этот показатель важен при оценке обеспеченности каротином крупного рогатого скота, так как в крови этих животных наряду с витамином A содержится значительное количество каротниа в отличие от других ВИДОВ Животных (лошадей, ПТИЦЫ) . Спектрофотометрическое определение витамина Аи каротина в сыворотке крови (по Бессею в модификации А. А. Анисовой с дополнениями И. П. Кондрахина), Сущность метода. Метод основан на щелочном гидролизе и экстракции витамина А и каротина из сыворотки крови при помощи малолетучих растворителей и последующем спектрофотометрическом измерении поглощения света раствором (при длине волны 328 нм для витамина А и 460 им для каротина) до и после разрушения витамина А ультрафнолетовыми лучами. Приборы и посуда. Спектрофотометры СФ-4, СФ-4а и СФ-16; кварцевая лампа ПРК-4; центрифуга; водяная баня; вентилятор настольный; пробирка с притертыми пробками из стекла пирекс, пропускающего ультрафиолетовые лучи; 55X8 мм; пробирки центрифужные; пипетки с резиновыми баллончиками. ем 11Реактивы.н. KOH+10| н. КОНобъемовв 90%-номабсолютногоэтиловомспирта). Реактивспирту готовят(1 объ-в день употребления. Ксилол-октановая смесь (1:1). Реактивы должны быть химически чистыми. Готовят за несколько часов до начала анализа. по 3Ходмл определения.сыворотки и Вдобавляютцентрифужныепо 3 пробиркимл | н. спиртовогонабирают пипеткойраствора KOH. Содержимое пробирок перемешивают тонкой стеклянной палочкой до образования однородной смеси и ставят для гидролиза в водяную баню па 20 мин при 60°C, Затем пробирки охлаждают в воде со льдом в течение 10 мини, добавляют в каждую по 3 мл ксилоло-октановой смеси, закрывают пробкамн и сильно встряхивают с помощью прибора иля вручную. Затем пробирки вновь охлаждают в течение 10 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. . Верхний слой, состоящий из ксилоло-октановой смеси и содержащий витамин А и каротиноиды, отсасывают пипеткой со шприцем в кварцевую кювету на 10 мм. В контрольную кювету паливают ксилоло-октановую смесь и приступают к спектрофотометрированию. Определение каротина проводят при длине волны 460 им. Определение витамина А производят путем измерения до и пос-
204
© облучения проб ультрафиолетовыми лучамн при длине волны {28 им. Для этого пробы переносят пипеткой из кюветы в пробирки из стекла пирекс, закрывают пробками и облучают лампой PK на расстоянии 30 см в течение | ч, Для охлаждения пробирок применяют настольный вентилятор. По разности отсчетов при сиектрофотометрии до н после облучения определяют концентрацию витамина Ав сыворотке крови. Расчеты проводят по формулам: Каротин, мкг=Е вв 480, где Еи— экстинкция раствора при длине волны 460 им; 480— коэффициент для каротина. Витамин A, мкг% = (Es до облучения—Езэв после облучения)Ж X637, где Еззв — экстинкция раствора при длине волны 328 нм; 637 — коэффициент для витамина А. Содержание витамнна А в сыворотке крови определяют у животных всех видов, а каротин — только у крупного рогатого скота, лошадей и птицы Если в лаборатории нет спектрофотометра, определение BATAMHна А проводят по методике, описанной выше. При этом коицентрапию каротиноидов в сыворотке крови определяют в эфирном экстракте, полученном после экстрагирования омыленного образца и высушивания его сульфатом натрия. Во многих лабораториях широко ирнменяется упрощенный метод определения каротина в сыворотке крови без предварительного омыления образца.
Определение каротина в сыворотке крови
Сущность метода. Извлечение каротина из белковых фракций сыворотки крови петролейным или этиловым эфиром с последующим колориметрированием на фотоколориметре при синем светофильтре или со стандартной шкалой двухромовокислого калия. Приборы и посуда. Фотоэлектроколориметр; центрифуги; мерные цилиндры; пробирки центрифужные; пробирки мерные; пипетки; стеклянные палочки. Реактивы. Эфир наркозный или петролейный; спирт этиловый 96%-ный; раствор двухромовокислого калия (720 mrp | a дистиллированной воды); колориметрическая шкала, приготовленная из основного раствора двухромовокислого калия (720 мг KeCr.O7 в 1 a дистиллированной воды). Ход определения. В центрифужную пробирку берут пипеткой 1—3 мл сыворотки (в зависимости от предполагаемого содержания каротина), добавляют 3—6 мл этилового спирта. Пронеходит осаждение белков сыворотки. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой, затем центрифугируют в течение 15 wun, Спирт с осадка сливают, а к осажденному белку добавляют 3—4 мл петролейного нли‘серного эфира, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 10 мин. Прозрачный эфирный экстракт сливают в мерную пробирку, обтем доводят чистым эфиром до 5 мл, закрывают пробкой. В том случае, если после экстракции эфиром белковый осадок нмеет желтую окраску, экстракцию каротина проводят повторно, а полученный экстракт соединяют с первым и измеряют общий объем. Интенсивность окраски эфирного экстракта колориметрируют с раствором двухромовокислого калия на фотоэлектроколориметре. Содержание каротина вычисляют по формуле, приведенной при определении каротина в корме. Расчет ведется на 100 мл сыворотки (в мг). 205
