Определение витамина А на основе реакции Карр—Прайса с треххлористой сурьмой имеет недостатки. Один из них — чувствительность реакции к влаге и необходимость отмывать кюветы соляной кислотой и водой с последующим высушиванием. Кроме того, для определения витамина А этим методом требуется большое количество сыворотки крови, что не всегда возможно, так как из одной пробы крови одновременно отбирают часть сыворотки для исследования в ней мииеральшых веществ, кетоновых тел, каротина и других витаминов.Для определения содержания витамина А в меньших количествах сыворотки крови предложен спектрофотометрический метод Бессея в модификации А. А. Анисовой с дополнениями, внесенными доцентом кафедры терапии Московской ветеринарной академии И. П. Копдрахиным. Спектрофотометрический способ много проше и точнее. При этом нет необходимости готовить стандартные растворы и строить калибровочную кривую. К тому же можно параллельно определять содержание каротина B сыворотке крови. Этот показатель важен при оценке обеспеченности каротином крупного рогатого скота, так как в крови этих животных наряду с витамином A содержится значительное количество каротниа в отличие от других ВИДОВ Животных (лошадей, ПТИЦЫ) . Спектрофотометрическое определение витамина Аи каротина в сыворотке крови (по Бессею в модификации А. А. Анисовой с дополнениями И. П. Кондрахина), Сущность метода. Метод основан на щелочном гидролизе и экстракции витамина А и каротина из сыворотки крови при помощи малолетучих растворителей и последующем спектрофотометрическом измерении поглощения света раствором (при длине волны 328 нм для витамина А и 460 им для каротина) до и после разрушения витамина А ультрафнолетовыми лучами. Приборы и посуда. Спектрофотометры СФ-4, СФ-4а и СФ-16; кварцевая лампа ПРК-4; центрифуга; водяная баня; вентилятор настольный; пробирка с притертыми пробками из стекла пирекс, пропускающего ультрафиолетовые лучи; 55X8 мм; пробирки центрифужные; пипетки с резиновыми баллончиками. ем 11Реактивы.н. KOH+10| н. КОНобъемовв 90%-номабсолютногоэтиловомспирта). Реактивспирту готовят(1 объ-в день употребления. Ксилол-октановая смесь (1:1). Реактивы должны быть химически чистыми. Готовят за несколько часов до начала анализа. по 3Ходмл определения.сыворотки и Вдобавляютцентрифужныепо 3 пробиркимл | н. спиртовогонабирают пипеткойраствора KOH. Содержимое пробирок перемешивают тонкой стеклянной палочкой до образования однородной смеси и ставят для гидролиза в водяную баню па 20 мин при 60°C, Затем пробирки охлаждают в воде со льдом в течение 10 мини, добавляют в каждую по 3 мл ксилоло-октановой смеси, закрывают пробкамн и сильно встряхивают с помощью прибора иля вручную. Затем пробирки вновь охлаждают в течение 10 мин, после чего центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин. . Верхний слой, состоящий из ксилоло-октановой смеси и содержащий витамин А и каротиноиды, отсасывают пипеткой со шприцем в кварцевую кювету на 10 мм. В контрольную кювету паливают ксилоло-октановую смесь и приступают к спектрофотометрированию. Определение каротина проводят при длине волны 460 им. Определение витамина А производят путем измерения до и пос-
204
© облучения проб ультрафиолетовыми лучамн при длине волны {28 им. Для этого пробы переносят пипеткой из кюветы в пробирки из стекла пирекс, закрывают пробками и облучают лампой PK на расстоянии 30 см в течение | ч, Для охлаждения пробирок применяют настольный вентилятор. По разности отсчетов при сиектрофотометрии до н после облучения определяют концентрацию витамина Ав сыворотке крови. Расчеты проводят по формулам: Каротин, мкг=Е вв 480, где Еи— экстинкция раствора при длине волны 460 им; 480— коэффициент для каротина. Витамин A, мкг% = (Es до облучения—Езэв после облучения)Ж X637, где Еззв — экстинкция раствора при длине волны 328 нм; 637 — коэффициент для витамина А. Содержание витамнна А в сыворотке крови определяют у животных всех видов, а каротин — только у крупного рогатого скота, лошадей и птицы Если в лаборатории нет спектрофотометра, определение BATAMHна А проводят по методике, описанной выше. При этом коицентрапию каротиноидов в сыворотке крови определяют в эфирном экстракте, полученном после экстрагирования омыленного образца и высушивания его сульфатом натрия. Во многих лабораториях широко ирнменяется упрощенный метод определения каротина в сыворотке крови без предварительного омыления образца.
Определение каротина в сыворотке крови
Сущность метода. Извлечение каротина из белковых фракций сыворотки крови петролейным или этиловым эфиром с последующим колориметрированием на фотоколориметре при синем светофильтре или со стандартной шкалой двухромовокислого калия. Приборы и посуда. Фотоэлектроколориметр; центрифуги; мерные цилиндры; пробирки центрифужные; пробирки мерные; пипетки; стеклянные палочки. Реактивы. Эфир наркозный или петролейный; спирт этиловый 96%-ный; раствор двухромовокислого калия (720 mrp | a дистиллированной воды); колориметрическая шкала, приготовленная из основного раствора двухромовокислого калия (720 мг KeCr.O7 в 1 a дистиллированной воды). Ход определения. В центрифужную пробирку берут пипеткой 1—3 мл сыворотки (в зависимости от предполагаемого содержания каротина), добавляют 3—6 мл этилового спирта. Пронеходит осаждение белков сыворотки. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой, затем центрифугируют в течение 15 wun, Спирт с осадка сливают, а к осажденному белку добавляют 3—4 мл петролейного нли‘серного эфира, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют 10 мин. Прозрачный эфирный экстракт сливают в мерную пробирку, обтем доводят чистым эфиром до 5 мл, закрывают пробкой. В том случае, если после экстракции эфиром белковый осадок нмеет желтую окраску, экстракцию каротина проводят повторно, а полученный экстракт соединяют с первым и измеряют общий объем. Интенсивность окраски эфирного экстракта колориметрируют с раствором двухромовокислого калия на фотоэлектроколориметре. Содержание каротина вычисляют по формуле, приведенной при определении каротина в корме. Расчет ведется на 100 мл сыворотки (в мг). 205
При отсутствии колориметра можно использовать колориметрическую шкалу. Количество каротина высчитывают по формуле:
К.И. 100 r= @ z eae вЕ oxpacxe,OeMs nopeК cae. к oi У— объем эфирного экстракта, мл; ЕВЕ СИ taboporsasten, А > мл; J ленияновной растворкаротина720 мг вК»Сг»Огкормахв 1 aи водысыворотке(1 млмосновногокрови.раство-Ocра соответствует 0,00416| mr каротина) у
- Колориметрическая шкала для определения каротина
| про- №| бирки | | и Основной | раствор, мл | вода, | мл | | Ш и |SMe wa | раствора, т | в | Номер | бирки про- | es | Мы |Основной раствор, мл | | ли и Вода, мл | | | а тие раствора, apd |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 10,0 | 0,0 | 0,004160 | 13 | 4,0 | 6,0 | 0,001664 | |
| 2 | 9,5 | 0,5 | 0,003952 | 14 | 5,5 | 6,5 | 0, 001456 | |
| 3 | 9,0 | 1,0 | 0,003744 | 15 | 3,0 | 7,0 | 0, 001248 | |
| 4 | 8,5 | 1,5 | 0,003536 | 16 | 2,5 | 7,5 | 0,001040 | |
| 5 | 8,0 | 2,0 | 0,003328 | 17 | 2,0 | 8,0 | 0, 000832 | |
| 6 | 7,5 | 2,5 | 0,003120 | 18 | 1,5 | 8,5 | — | 0,000624 |
| 7 | 7,0 | 3,0 | 0,002912 | 19 | 1,0 | 9,0 | 0,000416 | |
| 8 | 6,5 | 3,5 | 0,002704 | 20 | 0,5 | 9,5 | — | 0,000208 |
| 9 | 6,0 | 4,0 | 0,002496 | 21 | 0,4 | 9,5 | 0,000166 | |
| 10 | 5,5 | 4,5 | 0,002288 | 22 | 0,3 | 9,7 | 0,000125 | |
| И | 5,0 | 5,0 | 0,002080 | 23 | 0,2 | 9,8 | 0,000083 | |
| 12 | 4,5 | 5,5 | 0,001872 | 24 | 0,1 | O,8) ы | 0,000042 |
и Определение витаминаА и каротиноидов в яйце Содержание витамина А и каротиноидов в желтке характеризует обеспеченность.птиц А-витаминным питанием и одновременно используетсяОпределениепри оценкевитаминаинкубационныхА. При анализекачествяичногояиц. желтка из средней пробы (10 желтков) в колбу для омыления берут навеску 5 г, добавляют 10 мл дистиллированной воды, перемещивают, затем добавляют 30 мл этилового спирта, снова перемешивают, добавляют 100 мг пирогаллола, 10 мл 60%-ного раствора КОН и нагревают в водяной бане при 90—95?С с обратным холодильником (его можно заменить небольшими химическими воронками) не менее | ч. В процессе омыления смесь в колбе осторожно помешивают круговыми движениями. После омыления колбу охлаждают, содержимое переносят в делительную воронку, куда добавляют 20 мл дистиллированной воды. Экстракцию проводят этиловым эфиром 4 раза {первый раз 40 мл, затем по 30 мл).
206
