1. Полученную реакционную смесь раскапать в подготовленные пробирки.

2. Добавить в каждую пробирку, кроме пробирки с отрицательным контролем, по 1,5 мкл матричной ДНК.

3. Поместить пробирки в амплификатор и запустить соответствующий режим, который должен соответствовать праймерам, используемым в реакции. Режим амплификации:

1 95°С – 5 мин;

1. 95°С – 30 с;

2. 64°С – 30 с;

3. 72°С – 30 с;

4. Стадии 2–4 повторяются 35 раз;

5. 72°С – 10 мин;

6. Если образцы не анализируются сразу после окончания амплификации, их следует поместить в холодильник на –20°С.

Рестрикционный анализ гена инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 )

Необходимые реактивы: амплификат, рестриктаза SnaBI, 10х рестрикционный буфер, бидистиллированная вода, 6×DNA Loading Dye (краситель – 6×MassRuler™, раствор с красителями для нанесения образцов на гель), раствор бромистого 10 мг/мл этидия, маркера молекулярных масс TrackIt™ 50 bp DNA Ladder, агароза, 10×ТБЕ буфер

Необходимое оборудование и материалы: ПЦР-бокс, вортекс, камера для электрофореза, заливочный столик с гребенками, микроволновая печь или плитка, источник тока, трансиллюминатор для агарозно-этидиевых гелей, холодильник с морозильной камерой на –20°С, амплификатор, дозаторы с переменным объемом (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (0,1–10 мкл, 1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), мерный стакан (100 мл – 1 шт., 1000 мл – 1 шт.), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1,5 мл, микропробирки пластиковые с плоской крышкой типа «Eppendorf» объемом 0,2 или 0,5 мл соответственно амплификатору, штативы для микропробирок, лента лабораторная «Parafilm M», спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. В реакционную смесь общим объемом 13,2 мкл вносят 1,3 мкл рестриктазного буфера (10x), 0,3 мкл рестриктазы SspI, 5 мкл ПЦР-продукта. Объем смеси доводят бидистилированной водой до 13,2 мкл.

2. Полученную смесь перемешать на вортексе и инкубировать в термостате в течение 16 часов при 37°С. Все операции проводить на лабораторном столе,

ферменты либо поместить в лед, либо кратковременно извлекать из морозильной камеры.

1. Приготовить 2%-ный агарозный гель для проведения электрофореза.

2. Нанести на гель рестрикцированные образцы, маркер молекулярных масс. Продукты рестрикции разделить в готовом агарозном геле в течение 30 минут при напряжении 150 В.

3. Рассмотреть гель с помощью трансиллюминатора в УФ-свете.

Полиморфизм нуклеотидной последовательности гена инсулиноподобного фактора роста-1 bIGF - 1 в области Р1 промоторного региона идентифицирован как Т→С трансверсия. Эта замена распознается рестриктазой SnaBI . Амплифицируется фрагмент гена bIGF - 1 длиной 249 п.н. [304]. Длина фрагментов после рестрикции составляет 223 и 26 п.н. На электрофореграмме могут быть видны варианты полос определенной длины, характерные для генотипов: одна полоса 249 п.н. (генотип bIGF - 1 -SnaBI^ВВ ); две полосы 223 и 26 п.н. (генотип bIGF - 1 -SnaBI^АA ); три полосы 249, 223 и 26 п.н. (генотип bIGF - 1 - SnaBI^АB ). Фрагмент 26 п.н. на агарозном геле не визуализируется (рисунок 19).

Дорожка 1 – маркер молекулярных масс O’Range Ruler^TM 50 bp DNA Ladder, Fermentas, Литва;

Дорожка 2 – ПЦР-продукт 249 п.н. фрагмента гена bIGF - 1 -SnaBI; Дорожки 3, 4 – фрагменты рестрикции 249 и 223 п.н., соответствующие генотипу -SnaBI^АВ ;

Дорожки 5, 6 – фрагмент рестрикции 223 п.н., соответствующий генотипу bIGF - 1 -SnaBI^АА ;

Дорожка 7 – фрагмент рестрикции 249 п.н., соответствующий генотипу bIGF - 1 -SnaBI^ВВ . Фрагмент 26 п.н. не визуализируется. Положение на геле специфических полос показано стрелками.

Рисунок 19 – Электрофореграмма ДНК-типирования полиморфизма bIGF - 1 -SnaBI

Контрольные вопросы:

1. Из каких компонентов состоит реакционная смесь для амплификации ДНК?

2. Составьте реакционную смесь по гену инсулиноподобного фактора роста-1 ( bIGF-1 ), которая готовится в объеме 20 мкл и содержит 2 мкл 10х буфера, 2 мкл MgCL2, 0,25 мкл дНТФ (dNTP’s), 1,7 мкл каждого праймера, 0,3 мкл Taq-полимеразы, 1,5 мкл геномной ДНК.

3. Проведите постановку ПЦР, используя программу: горячий старт – 5 минут при 95°С; 35 циклов: денатурация – 30 секунд при 95°С; отжиг – 30 секунд при 64°С; синтез – 30 секунд при 72°С; достройка – 10 минут при 72°С.

4. Проведите визуализацию амплификата по гену инсулиноподобного фактора роста-1 методом горизонтального электрофореза. Детекция результатов амплификации по гену гормона роста: 5 мкл продукта амплификации + 0,5 мкл бромфенол голубого, раскапать в 1,5% агарозный гель (V=110, 30-35 мин.).

5. Проведите рестрикцию амплифицированного участка гена инсулиноподобного фактора роста-1. Для рестрикции амплифицированного участка гена bIGF-1 используют эндонуклеазу SnaBI. Реакцию проводят при температуре 37°С. Продукты рестрикции генов разделяют электрофоретически в 2% агарозном геле (при напряжении 150 В) 30 мин в ТВЕ буфере при УФсвете с использованием бромистого этидия на системе гель-документирования.

3.5 Ошибки ПЦР-ПДРФ и их предотвращение

Достоверность заключений по любому эксперименту определяется качеством полученных результатов. Ошибки проведения ПЦР-ПДРФ могут быть обусловлены различными причинами. Минимизирование ошибок возможно при оценке особенностей используемых экспериментальных методов, их оптимизации, надлежащему использованию контролей, повторностей, а также разработки статистических подходов для выявления ошибок [313].

Ошибки разделены исследователями на категории [314].

1 - обусловленные особенностями собственно последовательности молекулы ДНК.

2 - низкое качество и/или недостаточное количество ДНК. Как низкое качество, так и малое количество ДНК обуславливают «выпадение» (dropout) аллелей в гетерозиготах (амплификация только одной предпочтительно более короткой аллели). При контаминации образцов ДНК возможна амплификация контаминантных аллелей. Одним из решений проблемы в случае малого количества ДНК предложен метод разделения образца на несколько пробирок и проведение реакции амплификации в каждой из них [315].