неподвижным модулями. Прибор измеряет поглощение света в столбике образца.

Измерение концентрации ДНК с помощью спектрофотометра Dynamica Halo DNAmaster

Необходимые реактивы: пробы ДНК, элюирующий раствор

Необходимое оборудование и материалы: спектрофотометр Dynamica Halo DNAmaster, дозаторы с переменным объемом (1–10 мкл), наконечники для дозаторов (1–10 мкл), безволокнистые тампоны или салфетки, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Включить прибор, выбрать необходимый режим измерения с помощью кнопок на экране.

2. Выбрать необходимую крышку для кюветы. Измерение ДНК проводят с кюветой 1 мм (factor 10) – для измерения концентрации ДНК в пределах от 13 до 850 нг/мкл или с кюветой 0,2 мм (factor 50) – для измерения концентрации ДНК в пределах от 63 до 4250 нг/мкл.

3. Перед измерением концентрации ДНК необходимо на кювету нанести 4 мкл элюирующего раствора. Кювету закрыть крышкой, установить в держатель. На приборе нажать кнопку «Zero».

4. Остаток раствора на кювете убрать при помощи безволокнистых тампонов или салфеток.

5. Нанести на кювету 4 мкл образца ДНК, закрыть крышкой, установить в держатель. На приборе нажать кнопку «Read». На экране прибора будет выдана концентрация ДНК в нг/мкл и чистота (А260/280).

6. Остаток раствора на кювете убрать при помощи безволокнистых тампонов или салфеток.

7. Повторить пункт 5 с другим образцом. При определении концентрации большого количества образцов ДНК результаты необходимо периодически сбрасывать элюирующим раствором (например, после каждого 5-го измерения).

Измерение концентрации ДНК с помощью Qubit® 3.0 Fluorometer

Необходимые реактивы: пробы ДНК, стандарты № 1 и № 2 для проведения анализа на Qubit, буфер для проведения анализа на Qubit, реагент для проведения анализа на Qubit.

Необходимое оборудование и материалы: Qubit® 3.0 Fluorometer, вортекс, микропробирки 0.5 мл, дозаторы с переменным объемом (1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), наконечники для дозаторов (1–10 мкл, 10–100 мкл, 100–1 000 мкл), пробирки типа «Eppendorf» объемом 1.5 мл, штативы для микропробирок, спирт для обработки столешницы и инструментов, емкости для отходов.

Ход работы:

1. Приготовить смесь для определения концентрации ДНК. Рассчитать необходимое количество реактивов по формулам:

2. N образцов ДНК + 2 (мкл) – для реагента Qubit;

3. (N образцов ДНК + 2)*199 - для буфера Qubit.

4. Перемешать буфер с реагентом на вортексе.

5. В пробирку добавить 190 мкл готовой смеси и 10 мкл стандарта № 1. Перемешать на вортексе.

6. В пробирку добавить 190 мкл готовой смеси и 10 мкл стандарта № 2. Перемешать на вортексе.

7. В пробирку добавить 190 мкл готовой смеси и 10 мкл образца ДНК. Перемешать на вортексе.

8. Далее на Qubit, пошагово следуя инструкции на приборе, определить концентрацию ДНК для каждого образца. Включить прибор, → выбрать тип измеряемых молекул ДНК и набор (HS/BR); → провести калибровку (New calibration), → внести в прибор стандарт 1, затем стандарт 2, → далее измерить образцы, для расчета концентрации в исходном образце, необходимо указать

количество внесенного образца.

Контрольные вопросы:

1. В чем принцип метода спектрофотометрического определения концентрации нуклеиновых кислот?

2. При какой длине волны оценивают концентрацию ДНК спектрофотометрическим методом: а) 260нм и 280нм; б) 280нм и 300нм; в) 180нм и 280нм; г) 200нм и 350нм.

3. Какая масса агарозы необходима для приготовления 150 мл 2.5%-ного геля?

4. Приготовить 1 % агарозный гель для проведения гель-электрофореза. Растворить 1 г агарозы в 99 мл 1хТВЕ (1 % гель). Нагреть до 100 °С для растворения агарозы, постоянно перемешивая раствор, и медленно охладить до 40–50 °С. Добавить в раствор агарозы бромистый этидий. Затем с помощью специальной кюветы и гребенки сформировать гель с лунками.

5. Определить качество выделенной ДНК методом электрофореза.

3.3 Проведение ПЦР-ПДРФ для генов молочных белков

Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом является стандартным анализом точковых мутаций для диагностики аллельного полиморфизма генов-кандидатов, связанных с продуктивными качествами сельскохозяйственных животных. По длине фрагментов (ПДРФ) делают вывод об отсутствии или наличии точковой мутации, а также о гомозиготности или гетерозиготности особи [309].

Метод ПЦР-ПДРФ дал возможность идентифицировать генотипы белков молока на ранних стадиях развития животного, что значительно ускоряет решение некоторых актуальных задач современной селекции. Использование ПЦР облегчает процедуру анализа и открывает возможность массовых исследований ДНК сельскохозяйственных животных и проведения

75